Name: coculture analysis of extracellular protein interactions affecting insulin secretion by pancreatic beta cells
Uploaded: 2013-06-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells at JoVE.com

Ce travail a été financé par les Instituts de la Santé subvention R01DK080971 et Juvenile Diabetes Research Foundation subvention 37-2009-44 nationale. Nous apprécions également le soutien reçu de la Pediatric Research Center Diabetes UCSD (CEDE).

1. La transfection de cellules HEK293 couche <ol><li> Préparer milieu cellulaire HEK293 en ajoutant à bouteilles de 500 mL de DMEM (avec 4,5 g / ml de glucose et rouge de phénol et sans glutamine): 50 ml de FBS, 5 ml 100X pénicilline / solution de streptomycine, 5 ml de solution de L-glutamine 100x et 500 amphotéricine ul B. </li><li> Plate sur les cellules HEK293 dans une plaque de 24 puits en utilisant 0,5 ml de HEK293 médias par puits. S&#39;assurer que les cellules sont réparties uniformément sur le fond d...

<ol>
	<li>Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+islet+structure+and+cellular+interactions+in+the+control+of+insulin+secretion.">Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion.</a> Islets. 3, 41-47 (2011).</li><li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets.">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129, 359-370 (2007).</li><li>Jain, R., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+the+endocrine+pancreas.">Cell-cell interactions in the endocrine pancreas.</a> Diabetes Obes. 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W., Madeddu, L., Kelly, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+secretory+granules+and+neuronal+synaptic+vesicles+have+three+integral+membrane+proteins+in+common.">Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common.</a> The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).</li><li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neurexin,+neuroligin,+and+their+cytoplasmic+binding+partners+in+the+pancreatic+beta-cells+and+the+involvement+of+neuroligin+in+insulin+secretion.">Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion.</a> Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).</li><li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+neuroligin-2+interactions+enhance+insulin+secretion+and+are+integral+to+pancreatic+beta+cell+function.">Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).</li><li>Kohnert, K. D., Hehmke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+suspensions+of+pancreatic+islet+cells:+a+comparison+of+methods.">Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+I:+digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue.">Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue.</a> J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+II:+purification+and+culture+of+human+islets.">Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets.</a> J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+beta-cell-to-beta-cell+interactions+are+required+for+integrated+responses+to+nutrient+stimuli:+enhanced+Ca2++and+insulin+secretory+responses+of+MIN6+pseudoislets.">Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets.</a> Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).</li><li>Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superfusion+of+dissociated+pancreatic+islet+cells+attached+to+Cytodex+beads.">Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads.</a> Diabetes. 31, 189-193 (1982).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression+in+HEK293+cells:+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis.">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).</li><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+a+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).</li><li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages.">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).</li></ol>

La méthode décrite ici co-culture est un moyen efficace pour déterminer l&#39;importance physiologique de protéines beta-cell-surface, transmembranaires spécifiques, et en particulier de leurs domaines extracellulaires. Par les cellules bêta de culture ou de cellules d&#39;insulinome (comme les cellules INS-1 utilisés ici) en contact avec les cellules HEK293 affichant une protéine d&#39;intérêt sur la surface de la cellule, les expériences peuvent être conçues pour déterminer les effets des interactions pr...

Nous décrivons ici une méthode pour faciliter les enquêtes sur la façon dont les domaines extracellulaires de protéines transmembranaires spécifiques affectent la sécrétion d&#39;insuline. La méthode des sondes les effets des interactions de la protéine d&#39;intérêt avec des protéines (ou éventuellement d&#39;autres molécules) sur la surface des cellules bêta pancréatiques. Le procédé permet des enquêtes de comment les protéines de surface cellulaire exprimée par des cellules bêta ou par d&#39;autres cellules voisines (par exemple des cellules endothéliales, des neurones, des cellules alpha du pancréas) affectent la fonction des cellules bêta par des interactions transcellulaires (soit par des interactions avec des partenaires d&#39;interaction sur la surface de côté cellules bêta). La membrane de plasma cellulaire contient un ensemble complexe de protéines structurales et fonctionnelles servant de ponts pour le milieu extracellulaire. Par la formation de connexions transcellulaires ou par l&#39;initiation des événements de signalisation en plastique, les interactions entre les protéines de surface cellulaire peuvent aider à coordonner l&#39;la fonction des cellules voisines. les cellules bêta du pancréas sont regroupés dans les îlots pancréatiques et d&#39;agir de manière coordonnée pour maintenir l&#39;homéostasie du glucose 1. Comme l&#39;a révélé, par exemple, par l&#39;importance des extracellulaire EPHA-ephrinA et neuroligin-2 interactions dans la régulation du glucose stimulée par la sécrétion d&#39;insuline, il devient de plus en plus clair que l&#39;augmentation de la connaissance des interactions extracellulaires qui se produisent entre les protéines sur les surfaces de côté cellules bêta seront d&#39;une grande importance pour acquérir une compréhension complète de la sécrétion d&#39;insuline, les bêta maturation fonctionnelle des cellules et le maintien de l&#39;homéostasie du glucose 1-3. Le but de la méthode décrite ici est de permettre à des enquêtes sur les effets sur la fonction des cellules bêta des interactions transcellulaires impliquant transmembranaire spécifique ou des protéines non-surface cellulaire associés. Par les cellules bêta co-culture avec des cellules HEK293 transfectées avec différentes constructions d&#39;expression, les effets sur la bla fonction des cellules ETA de différentes protéines de surface cellulaire ou des variantes mutantes de celui-ci peut être sondé efficacement. Ceci est accompli sans avoir à transfecter les cellules bêta eux-mêmes. L&#39;élucidation du rôle des interactions particulières transcellulaires par effet de choc, coup de grâce ou la surexpression des études dans les cellules bêta en culture ou in vivo nécessite perturbation directe de l&#39;ARNm des cellules bêta et l&#39;expression des protéines, ce qui pourrait affecter la santé des cellules bêta et / ou la fonction d&#39;une manière qui pourrait fausser l&#39;analyse des les effets des interactions spécifiques extracellulaires. Ces approches également modifier les niveaux des domaines intracellulaires des protéines ciblées et, de plus, ne laissez pas les effets dus aux interactions entre protéines sur ou dans la même cellule à se distinguer des effets des interactions transcellulaires. Ici, un procédé pour déterminer l&#39;effet des interactions spécifiques transcellulaires sur la capacité de sécréter de l&#39;insuline et de la réactivité des cellules bêta est Described. Cette méthode est applicable aux lignes des cellules bêta qui sécrètent l&#39;insuline, tels que les cellules INS-1, 4 et rongeurs primaire dissocié ou des cellules bêta humaines. Il est basé sur des modèles développés par coculture neurobiologistes, qui ont trouvé que l&#39;exposition des neurones en culture à des protéines neuronales spécifiques exprimés sur HEK293 (ou COS) des couches de cellules pourrait identifier les protéines qui conduisent à la formation des synapses 5,6. Étant donné les parallèles entre les mécanismes de sécrétion des synapses neuronales et des cellules bêta, nous avons pensé que la fonction des cellules bêta et la maturation fonctionnelle pourraient être conduits par des interactions similaires transcellulaires 7-9. Afin de sonder ces interactions, nous avons développé le système décrit ici, dans lequel les cellules bêta sont co-cultivées sur une couche de cellules HEK293 exprimant une protéine d&#39;intérêt 10. Ce système permet le cytoplasme des cellules bêta de rester intact pendant des interactions protéine-protéine extracellulaire sont manipulés.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA 3.3 vector/backbone</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K830001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18324012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-312</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep solution</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-652-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-808-1/30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-404</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-434</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-710-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell stripper</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45000-668</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>BD</td>
			<td>1368065</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-130</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879-100MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R0278</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture analysis of extracellular protein interactions affecting insulin secretion by pancreatic beta cells

Les interactions entre les protéines de surface cellulaire aider à coordonner la fonction des cellules voisines. les cellules bêta du pancréas sont regroupés au sein des îlots pancréatiques et d&#39;agir de manière coordonnée pour maintenir l&#39;homéostasie du glucose. Il devient de plus en plus clair que les interactions entre protéines transmembranaires à la surface des cellules bêta adjacents sont des déterminants importants de la fonction des cellules bêta. L&#39;élucidation du rôle des interactions particulières transcellulaires par effet de choc, coup de grâce ou la surexpression des études dans les cellules bêta en culture ou in vivo nécessite perturbation directe de l&#39;ARNm et l&#39;expression des protéines, ce qui pourrait affecter la santé des cellules bêta et / ou la fonction d&#39;une manière qui pourrait fausser les analyses des effets des interactions spécifiques. Ces approches modifient également les niveaux des domaines intracellulaires des protéines ciblées et peuvent prévenir les effets dus aux interactions entre protéines dans la même membrane cellulaire pour être affichéedistingué des effets des interactions transcellulaires. Ici, un procédé pour déterminer l&#39;effet des interactions spécifiques transcellulaires sur la capacité de sécréter de l&#39;insuline et de la réactivité des cellules bêta est présenté. Cette méthode est applicable aux lignes des cellules bêta, comme les cellules INS-1, et pour les cellules bêta primaires dissociées. Il est basé sur des modèles développés par coculture neurobiologistes, qui ont trouvé que l&#39;exposition des neurones en culture de protéines neuronales spécifiques exprimés sur HEK293 (ou COS) des couches de cellules protéines identifiées sont déterminantes pour stimuler la formation des synapses. Étant donné les parallèles entre les mécanismes de sécrétion des synapses neuronales et des cellules bêta, nous avons pensé que la maturation fonctionnelle des cellules bêta peut être entraînée par des interactions transcellulaires similaires. Nous avons développé un système où les cellules bêta sont cultivées sur une couche de cellules HEK293 exprimant une protéine d&#39;intérêt. Dans ce modèle, le cytoplasme des cellules bêta est intact tandis extracellulaire INTERACTIONS de protéine-protéinens sont manipulés. Bien que nous nous concentrons ici principalement sur les études de glucose stimulée par la sécrétion d&#39;insuline, d&#39;autres procédés peuvent être analysés, par exemple, des changements dans l&#39;expression des gènes tels que déterminés par immuno ou qPCR.

En utilisant la méthode décrite ici, nous avons testé l&#39;effet de différentes variantes de la neuroligin de protéines sur la sécrétion d&#39;insuline. Cela complète notre travail publié étudier l&#39;effet de neuroligin-2 sur la fonction des cellules bêta 10. Figure 2, par exemple, décrit les résultats obtenus à partir INS-1 co-culture de cellules bêta avec des cellules HEK293 transfectées pour exprimer un neuroligin isoforme appelée ici NL- X. Cette expérience a été co...

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Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Les interactions entre protéines transcellulaires sont des déterminants importants de la fonction des cellules bêta du pancréas. Détaillé ici est une méthode adaptée à partir d&#39;un modèle de co-culture de synaptogénèse-pour étudier comment les protéines transmembranaires spécifiques influencent la sécrétion d&#39;insuline. Cellules HEK293 transfectées expriment des protéines d&#39;intérêt, les cellules bêta n&#39;ont pas besoin d&#39;être transfectées ou non directement perturbé.

Analyse Coculture des interactions protéiques extracellulaires affecter la sécrétion d&#39;insuline par les cellules bêta du pancréas

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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Amélioration de l&#39;administration d&#39;insuline IV dans un hôpital communautaire

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