Name: coculture analysis of extracellular protein interactions affecting insulin secretion by pancreatic beta cells
Uploaded: 2013-06-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Zuschuss R01DK080971 und Juvenile Diabetes Research Foundation Grant 37-2009-44 unterstützt. Wir schätzen auch Unterstützung von der UCSD Pediatric Diabetes Research Center (PDRC) übermittelt.

1. Transfektion von HEK293 Schicht <ol><li> Bereiten HEK293 Zellmedium durch Zugabe zu 500 ml Flaschen DMEM (mit 4,5 g / ml Glucose und Phenolrot und ohne Glutamin): 50 ml FBS, 5 ml 100X Penicillin / Streptomycin-Lösung, 5 ml 100x L-Glutamin-Lösung und 500 ul Amphotericin B. </li><li> Platte aus HEK293-Zellen in einer 24-Well-Platte unter Verwendung von 0,5 ml pro Vertiefung HEK293 Medien. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig auf die Unterseite der Platte verteilt. </li><li> Wenn HEK293-Zellen 100% Konf...

<ol>
	<li>Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+islet+structure+and+cellular+interactions+in+the+control+of+insulin+secretion.">Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion.</a> Islets. 3, 41-47 (2011).</li><li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets.">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129, 359-370 (2007).</li><li>Jain, R., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+the+endocrine+pancreas.">Cell-cell interactions in the endocrine pancreas.</a> Diabetes Obes. 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W., Madeddu, L., Kelly, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+secretory+granules+and+neuronal+synaptic+vesicles+have+three+integral+membrane+proteins+in+common.">Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common.</a> The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).</li><li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neurexin,+neuroligin,+and+their+cytoplasmic+binding+partners+in+the+pancreatic+beta-cells+and+the+involvement+of+neuroligin+in+insulin+secretion.">Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion.</a> Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).</li><li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+neuroligin-2+interactions+enhance+insulin+secretion+and+are+integral+to+pancreatic+beta+cell+function.">Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).</li><li>Kohnert, K. D., Hehmke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+suspensions+of+pancreatic+islet+cells:+a+comparison+of+methods.">Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+I:+digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue.">Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue.</a> J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+II:+purification+and+culture+of+human+islets.">Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets.</a> J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+beta-cell-to-beta-cell+interactions+are+required+for+integrated+responses+to+nutrient+stimuli:+enhanced+Ca2++and+insulin+secretory+responses+of+MIN6+pseudoislets.">Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets.</a> Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).</li><li>Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superfusion+of+dissociated+pancreatic+islet+cells+attached+to+Cytodex+beads.">Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads.</a> Diabetes. 31, 189-193 (1982).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression+in+HEK293+cells:+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis.">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).</li><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+a+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).</li><li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages.">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).</li></ol>

Die Kokultur hier beschriebene Verfahren bietet einen effektiven Weg, um die physiologische Bedeutung der spezifischen Beta-Zell-Oberfläche, Transmembranproteine ​​bestimmen und speziell ihrer extrazellulären Domänen. Durch Kultivierung Betazellen oder Insulinomazellen (wie die INS-1-Zellen verwendet hier) in Kontakt mit HEK293 Zellen, die ein Protein von Interesse auf der Zelloberfläche kann Experimente entwickelt, um die Auswirkungen der extrazellulären Protein-Protein-Wechselwirkungen stören, ohne direkt zu...

Wir beschreiben hier eine Methode, um Untersuchungen, wie die extrazellulären Domänen spezifischer Transmembranproteine ​​beeinflussen Insulinsekretion zu erleichtern. Die Methode Sonden die Auswirkungen der Interaktionen des Proteins von Interesse mit Proteinen (oder möglicherweise andere Moleküle) auf der pankreatischen beta-Zelloberfläche. Das Verfahren ermöglicht Untersuchungen, wie Zelloberflächen-Proteine ​​durch Beta-Zellen oder anderen benachbarten Zellen (zB endothelialen Zellen, Neuronen, Bauchspeicheldrüsen-alpha-Zellen) exprimiert beeinflussen Betazellfunktion durch transzellulären Wechselwirkungen (zB durch Wechselwirkung mit Interaktionspartner auf der Oberfläche des benachbarten Beta-Zellen). Die zelluläre Plasmamembran enthält eine komplexe Anordnung von struktureller und funktioneller Proteine, die als Brücken an die extrazelluläre Umgebung. Durch Bildung von transzellulären Verbindungen oder durch Einleitung von Kunststoff-Signalwege können Wechselwirkungen zwischen Zelloberflächen-Proteine ​​helfen, koordinieren dieFunktion von benachbarten Zellen. Betazellen des Pankreas sind zusammen in den Langerhans-Inseln gruppierten und handeln in einer koordinierten Art und Weise, um Glukose-Homöostase 1 aufrecht zu erhalten. Wie soeben bekannt wurde, zum Beispiel durch die Bedeutung der extrazellulären EphA-EphrinA und neuroligin-2-Wechselwirkungen in der Regulation des Glukose-stimulierte Insulinsekretion, wird es immer klarer, dass eine erhöhte Kenntnis der auftretenden Wechselwirkungen zwischen extrazellulären Proteine ​​auf den Oberflächen von benachbarten Beta-Zellen wird von großer Bedeutung für die Gewinnung ein umfassendes Verständnis der Insulinsekretion der Beta-Zellen funktionelle Reifung und der Aufrechterhaltung der Glukose-Homöostase 1-3 sein. Das Ziel der hier beschriebenen Methode ist es, Untersuchungen der Auswirkungen auf die Beta-Zell-Funktion transzellulären Wechselwirkungen mit spezifischen Transmembran oder anderweitig-Zell-Oberflächen-assoziierten Proteinen ermöglichen. Durch Co-Kultivierung Beta-Zellen mit HEK293 Zellen mit unterschiedlichen Ausdruck Konstrukten transfiziert, die Auswirkungen auf die beta-Zell-Funktion verschiedener Zelloberflächen-Proteine ​​oder mutierten Varianten davon können effizient sondiert. Dies wird ohne transfektieren die Beta-Zellen selbst zu erreichen. Aufklärung der Rolle der insbesondere transzellulären Wechselwirkungen durch Knockdown, Knockout oder Überexpression Studien in kultivierten Beta-Zellen oder in vivo erfordert direkte Störung der Beta-Zell-mRNA und Protein-Expression, möglicherweise beeinflussen Betazellen Gesundheit und / oder die Funktion in einer Weise, die Analysen verwechseln könnte die Auswirkungen der extrazellulären Wechselwirkungen. Diese nähert sich auch ändern Niveaus der intrazellulären Domänen der Zielproteine ​​und ferner nicht erlauben Effekte aufgrund von Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die am oder in der gleichen Zelle unter den Auswirkungen von Wechselwirkungen transzellulären unterscheiden. Hier ist ein Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von spezifischen transzellulären Wechselwirkungen auf die Insulin-sezernierenden Kapazität und Reaktionsfähigkeit der Betazellen Artbezibed. Dieses Verfahren ist für insulinproduzierenden ß-Zelllinien, wie INS-1-Zellen 4 und dissoziierte primären Nagetier oder humanen beta-Zellen. Es basiert auf Kokultur Modelle von Neurobiologen, die, dass die Exposition von kultivierten Neuronen spezifische neuronale Proteine ​​auf HEK293 (oder COS) Zellschichten exprimiert gefunden entwickelten Proteine ​​identifizieren konnte, die Fahrt Synapsenbildung 5,6. Angesichts der Parallelen zwischen der sekretorischen Maschinerie der neuronalen Synapsen und der Beta-Zellen, begründeten wir, dass Beta-Zell-Funktion und funktionelle Reifung durch ähnliche transzellulären Wechselwirkungen 7-9 könnte angetrieben werden. Um diese Wechselwirkungen untersuchen, haben wir das hier beschriebene System in der Beta-Zellen auf einer Schicht aus HEK293 Zellen, die ein Protein von Interesse 10 sind co-kultiviert. Dieses System ermöglicht die Beta-Zell-Zytoplasma unangetastet bleiben, während extrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen manipuliert werden.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA 3.3 vector/backbone</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K830001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18324012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-312</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep solution</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-652-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-808-1/30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-404</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-434</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-710-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell stripper</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45000-668</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>BD</td>
			<td>1368065</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-130</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879-100MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R0278</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture analysis of extracellular protein interactions affecting insulin secretion by pancreatic beta cells

Wechselwirkungen zwischen Zelloberflächen-Proteine ​​zur Koordination der Funktion der benachbarten Zellen. Betazellen der Bauchspeicheldrüse zusammen innerhalb Pankreasinseln gruppierten und handeln in einer koordinierten Art und Weise, um Glukose-Homöostase aufrecht zu erhalten. Es wird zunehmend deutlich, dass Wechselwirkungen zwischen Transmembranproteine ​​auf den Oberflächen der angrenzenden Beta-Zellen wichtige Determinanten der Beta-Zell-Funktion sind. Aufklärung der Rolle der insbesondere transzellulären Wechselwirkungen durch Knockdown, Knockout oder Überexpression Studien in kultivierten Beta-Zellen oder in vivo erfordert direkte Störung der mRNA und Protein-Expression, möglicherweise beeinflussen beta-Zelle Gesundheit und / oder die Funktion in einer Weise, die Analysen über die Auswirkungen verwechseln könnte von spezifischen Wechselwirkungen. Diese Ansätze auch ändern Niveaus der intrazellulären Domänen der Zielproteine ​​und kann Auswirkungen auf Wechselwirkungen zwischen Proteinen innerhalb der gleichen Zelle Membran zu verhindern, dass disunterschieden von den Auswirkungen der transzellulären Wechselwirkungen. Hier wird ein Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von spezifischen transzellulären Wechselwirkungen auf die Insulin-sezernierenden Kapazität und Reaktionsfähigkeit der Beta-Zellen präsentiert wird. Dieses Verfahren ist für Beta-Zell-Linien, wie INS-1-Zellen, und distanzierte primären Beta-Zellen. Es basiert auf Kokultur Modelle von Neurobiologen, die, dass die Exposition von kultivierten Neuronen spezifische neuronale Proteine ​​auf HEK293 (oder COS) Zellschichten identifizierten Proteine ​​wichtig für den Antrieb Synapsenbildung Ausdruck gefunden entwickelt wurde. Angesichts der Parallelen zwischen der sekretorischen Maschinerie der neuronalen Synapsen und der Beta-Zellen, begründeten wir, dass beta-Zelle funktionelle Reifung durch ähnliche transzellulären Wechselwirkungen könnte angetrieben werden. Wir entwickelten ein System, in dem Beta-Zellen auf einer Schicht aus HEK293 Zellen, die ein Protein von Interesse kultiviert werden. In diesem Modell wird das Beta-Zell-Zytoplasma unberührt, während extrazellulären Protein-Protein interactions manipuliert werden. Obwohl wir hier in erster Linie auf Studien von Glukose-stimulierte Insulinsekretion zu konzentrieren, können andere Prozesse analysiert werden, z. B. Veränderungen in der Genexpression durch Immunoblot oder qPCR bestimmt.

Mit dem hier beschriebenen Verfahren haben wir die Wirkung von verschiedenen Varianten des Proteins neuroligin auf die Insulinsekretion getestet. Dies ergänzt unsere veröffentlichte Arbeit untersucht die Wirkung von neuroligin-2 auf Beta-Zell-Funktion 10. Abbildung 2, zum Beispiel, stellt Ergebnisse von Cokultivierung INS-1 beta-Zellen mit HEK293-Zellen transfiziert, um einen Ausdruck zu erhalten neuroligin Isoform hier bezeichnet als NL- X. Dieses Experiment wurde entworfen, um die Hypothe...

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Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Transzelluläre Protein-Interaktionen sind wichtige Determinanten der Pankreas-Beta-Zell-Funktion. Hier ist eine Methode der detaillierten angepasste aus einer Co-Kultur-Modell-Synaptogenese zur Untersuchung, wie bestimmte Transmembranproteine ​​Insulinsekretion beeinflussen. HEK293 Zellen exprimieren Proteine ​​von Interesse; Beta-Zellen brauchen nicht transfiziert oder anderweitig direkt gestört.

Cokultur Analyse der extrazellulären Protein Wechselwirkungen, die Insulinsekretion durch Betazellen des Pankreas

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Improving IV Insulin Administration in a Community Hospital

Die Verbesserung der IV-Verabreichung von Insulin in einem Community Hospital

Diabetes mellitus is a major independent risk factor for increased morbidity and mortality in the hospitalized patient, and elevated blood glucose ...

Forschung

Medizin

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Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Co-Kultur-System mit einer Scheibe Organotypische Gehirn-und 3D-Sphäroid von Karzinomzellen

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Menschen Dupuytren&#39;sche<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur für das Studium der Myofibroblasten und extrazellulären Matrix-Interaktionen

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps

Neurodegenerative Erkrankungen im Tiermodell der chronischen Amyloid-beta-Oligomers Infusion wird durch Antikörper-Behandlung Angereichert mit osmotische Pumpen entgegen gewirkt

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It ...

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Anwendung von End-to-End-Anastomose in Roboter-zentrale Pankreatektomie

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Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

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Homogene Zeitaufgelösten Förster Resonanz Energie Transfer-basierten Test zur Erkennung von Insulin-Sekretion

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