Name: coculture analysis of extracellular protein interactions affecting insulin secretion by pancreatic beta cells
Uploaded: 2013-06-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells at JoVE.com

इस काम के स्वास्थ्य अनुदान R01DK080971 और किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन अनुदान 37-2009-44 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था. हम UCSD बाल चिकित्सा मधुमेह अनुसंधान केंद्र (PDRC) से प्राप्त समर्थन की सराहना करते हैं.

1. HEK293 लेयर के अभिकर्मक <ol><li> 50 मिलीलीटर एफबीएस, 5 मिलीलीटर 100X पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान, 5 मिलीलीटर 100x एल glutamine समाधान और 500 μl amphotericin: DMEM के 500 मिलीलीटर की बोतल (4.5 ग्राम / मिलीलीटर ग्लूकोज और फिनोल लाल के साथ ?...

<ol>
	<li>Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+islet+structure+and+cellular+interactions+in+the+control+of+insulin+secretion.">Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion.</a> Islets. 3, 41-47 (2011).</li><li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets.">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129, 359-370 (2007).</li><li>Jain, R., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+the+endocrine+pancreas.">Cell-cell interactions in the endocrine pancreas.</a> Diabetes Obes. Metab. 11, 159-167 (2009).</li><li>Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-secreting+cell+lines:+classification,+characteristics+and+potential+applications.">Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications.</a> Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).</li><li>Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+build+a+central+synapse:+clues+from+cell+culture.">How to build a central synapse: clues from cell culture.</a> Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).</li><li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons.">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li><li>Abderrahmani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+traits+are+required+for+glucose-induced+insulin+secretion.">Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion.</a> FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).</li><li>Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+secretory+granules+and+neuronal+synaptic+vesicles+have+three+integral+membrane+proteins+in+common.">Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common.</a> The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).</li><li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neurexin,+neuroligin,+and+their+cytoplasmic+binding+partners+in+the+pancreatic+beta-cells+and+the+involvement+of+neuroligin+in+insulin+secretion.">Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion.</a> Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).</li><li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+neuroligin-2+interactions+enhance+insulin+secretion+and+are+integral+to+pancreatic+beta+cell+function.">Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).</li><li>Kohnert, K. D., Hehmke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+suspensions+of+pancreatic+islet+cells:+a+comparison+of+methods.">Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+I:+digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue.">Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue.</a> J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+II:+purification+and+culture+of+human+islets.">Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets.</a> J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+beta-cell-to-beta-cell+interactions+are+required+for+integrated+responses+to+nutrient+stimuli:+enhanced+Ca2++and+insulin+secretory+responses+of+MIN6+pseudoislets.">Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets.</a> Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).</li><li>Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superfusion+of+dissociated+pancreatic+islet+cells+attached+to+Cytodex+beads.">Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads.</a> Diabetes. 31, 189-193 (1982).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression+in+HEK293+cells:+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis.">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).</li><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+a+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).</li><li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages.">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).</li></ol>

यहाँ वर्णित coculture विधि विशिष्ट बीटा सेल सतह, transmembrane प्रोटीन के शारीरिक महत्व को निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है, और विशेष रूप से उनके कोशिकी डोमेन की. कोशिका की सतह पर ब्याज की एक प्रो?...

हम यहाँ विशिष्ट transmembrane प्रोटीन की कोशिकी डोमेन इंसुलिन स्राव को प्रभावित कैसे की जांच की सुविधा के लिए एक विधि का वर्णन है. अग्नाशय बीटा कोशिका की सतह पर प्रोटीन (या संभवतः अन्य अणुओं) के साथ ब्याज की प्रोटीन की बातचीत की विधि जांच प्रभाव. विधि बीटा कोशिकाओं द्वारा या अन्य पड़ोसी कोशिकाओं (जैसे endothelial कोशिकाओं, न्यूरॉन्स, अग्नाशय अल्फा कोशिकाओं) द्वारा व्यक्त सेल सतह प्रोटीन transcellular बातचीत (यानी आसन्न की सतह पर बातचीत के सहयोगियों के साथ बातचीत के माध्यम से के माध्यम से बीटा सेल समारोह को प्रभावित करने की जांच की अनुमति देता है बीटा कोशिकाओं). सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली बाह्य वातावरण के लिए पुल के रूप में सेवारत संरचनात्मक और कार्यात्मक प्रोटीन का एक जटिल सरणी शामिल हैं. Transcellular कनेक्शन के गठन तक या प्लास्टिक के संकेत घटनाओं की दीक्षा से, सेल सतह प्रोटीन के बीच बातचीत समन्वय में मदद कर सकते हैंपड़ोसी की कोशिकाओं के समारोह. अग्नाशय बीटा कोशिकाओं अग्नाशय islets के भीतर एक समूह और ग्लूकोज homeostasis 1 बनाए रखने के लिए एक समन्वित फैशन में अभिनय कर रहे हैं. के रूप में बाह्य EphA-ephrinA और ग्लूकोज प्रेरित इंसुलिन स्राव के नियमन में neuroligin-2 बातचीत के महत्व से, उदाहरण के लिए, पता चला, यह कभी भी और अधिक स्पष्ट होता जा रहा है कि आसन्न की सतहों पर प्रोटीन के बीच होने वाली कोशिकी बातचीत की वृद्धि हुई ज्ञान बीटा कोशिकाओं को इंसुलिन के स्राव, बीटा सेल कार्यात्मक परिपक्वता और 1-3 ग्लूकोज homeostasis के रखरखाव की पूरी समझ पाने के लिए काफी महत्व का हो जाएगा. यहाँ वर्णित विधि का लक्ष्य विशिष्ट transmembrane या अन्यथा सेल सतह से जुड़े प्रोटीन को शामिल transcellular बातचीत का बीटा सेल समारोह पर प्रभाव की जांच के लिए सक्षम है. अलग अभिव्यक्ति निर्माणों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं, ख पर प्रभाव के साथ सह संवर्धन बीटा कोशिकाओं द्वाराअलग सेल सतह प्रोटीन या उत्परिवर्तित वेरिएंट की एटा सेल समारोह तत्संबंधी कुशलता की जांच की जा सकती है. इस बीटा कोशिकाओं को खुद transfect करने के लिए बिना पूरा किया है. सुसंस्कृत बीटा कोशिकाओं में या विवो में पछाड़ना, पीटकर या overexpression के अध्ययन के द्वारा विशेष transcellular बातचीत की भूमिका की व्याख्या संभवतः के विश्लेषण उलझाना सकता है कि मायनों में बीटा सेल स्वास्थ्य और / या समारोह को प्रभावित करने, बीटा सेल mRNA और प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रत्यक्ष गड़बड़ी जरूरी विशिष्ट कोशिकी बातचीत के प्रभाव. ये भी लक्षित प्रोटीन के intracellular डोमेन के स्तर में परिवर्तन और, आगे, transcellular बातचीत के प्रभाव से प्रतिष्ठित किया जाना पर या एक ही सेल में प्रोटीन के बीच बातचीत के कारण प्रभाव की अनुमति नहीं है दृष्टिकोण. इधर, बीटा कोशिकाओं से इंसुलिन स्रावित क्षमता और जवाबदेही पर विशिष्ट transcellular बातचीत के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए एक विधि descr हैibed. इस विधि में इस तरह आईएनएस-1 कोशिकाओं के रूप में 4 इंसुलिन स्रावित बीटा सेल लाइनों, के लिए और अलग प्राथमिक कृंतक या मानव बीटा कोशिकाओं के लिए लागू है. यह HEK293 (या भं.नि.) सेल परतों पर व्यक्त विशिष्ट neuronal प्रोटीन के लिए सभ्य न्यूरॉन्स की है कि जोखिम पाया जो neurobiologists, द्वारा विकसित coculture मॉडल पर आधारित है कि ड्राइव synapse गठन 5,6 प्रोटीन की पहचान कर सकता है. तंत्रिका synapses के स्रावी तंत्र के बीच और बीटा कोशिकाओं की समानताएं देखते हुए, हम बीटा सेल समारोह और कार्यात्मक परिपक्वता समान transcellular बातचीत 7-9 से संचालित किया जा सकता है समझाया. इन संबंधों की जांच करने के लिए, हम बीटा कोशिकाओं ब्याज 10 के प्रोटीन व्यक्त HEK293 कोशिकाओं की एक परत पर cocultured रहे हैं जिसमें यहाँ बताया प्रणाली विकसित की है. इस प्रणाली के बाह्य प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत छेड़छाड़ कर रहे हैं, जबकि बीटा सेल cytoplasm अछूता रहने के लिए अनुमति देता है.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA 3.3 vector/backbone</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K830001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18324012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-312</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep solution</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-652-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-808-1/30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-404</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-434</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-710-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell stripper</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45000-668</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>BD</td>
			<td>1368065</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-130</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879-100MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R0278</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture analysis of extracellular protein interactions affecting insulin secretion by pancreatic beta cells

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within pancreatic islets and act in a coordinated fashion to maintain glucose homeostasis. It is becoming increasingly clear that interactions between transmembrane proteins on the surfaces of adjacent beta cells are important determinants of beta-cell function.
Elucidation of the roles of particular transcellular interactions by knockdown, knockout or overexpression studies in cultured beta cells or in vivo necessitates direct perturbation of mRNA and protein expression, potentially affecting beta-cell health and/or function in ways that could confound analyses of the effects of specific interactions. These approaches also alter levels of the intracellular domains of the targeted proteins and may prevent effects due to interactions between proteins within the same cell membrane to be distinguished from the effects of transcellular interactions.
Here a method for determining the effect of specific transcellular interactions on the insulin secreting capacity and responsiveness of beta cells is presented. This method is applicable to beta-cell lines, such as INS-1 cells, and to dissociated primary beta cells. It is based on coculture models developed by neurobiologists, who found that exposure of cultured neurons to specific neuronal proteins expressed on HEK293 (or COS) cell layers identified proteins important for driving synapse formation. Given the parallels between the secretory machinery of neuronal synapses and of beta cells, we reasoned that beta-cell functional maturation might be driven by similar transcellular interactions. We developed a system where beta cells are cultured on a layer of HEK293 cells expressing a protein of interest. In this model, the beta-cell cytoplasm is untouched while extracellular protein-protein interactions are manipulated. Although we focus here primarily on studies of glucose-stimulated insulin secretion, other processes can be analyzed; for example, changes in gene expression as determined by immunoblotting or qPCR.

विधि का प्रयोग यहाँ वर्णित है, हम इंसुलिन स्राव पर प्रोटीन neuroligin की विभिन्न किस्मों के प्रभाव का परीक्षण किया है. इस बीटा सेल समारोह 10 पर neuroligin-2 के प्रभाव की जांच कर हमारे प्रकाशित काम पूरक. चित्रा 2,</st...

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Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Transcellular प्रोटीन बातचीत अग्नाशय बीटा सेल समारोह के महत्वपूर्ण निर्धारक हैं. है यहाँ विस्तृत एक विधि अनुकूलित विशिष्ट transmembrane प्रोटीन इंसुलिन स्राव को प्रभावित जांच कैसे synaptogenesis के लिए की एक coculture मॉडल से. ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं ब्याज की प्रोटीन व्यक्त; बीटा कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट या अन्यथा सीधे परेशान होने की जरूरत नहीं है.

अग्नाशय बीटा कोशिकाओं द्वारा इंसुलिन स्राव पीडि़त कोशिकी प्रोटीन की सहभागिता coculture विश्लेषण

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

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