Name: coculture analysis of extracellular protein interactions affecting insulin secretion by pancreatic beta cells
Uploaded: 2013-06-15T14:00:00
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この作品は、健康助成R01DK080971と若年性糖尿病研究財団助成37-2009-44の国立研究所によってサポートされていました。また、UCSD小児糖尿病研究センター（PDRC）から受け取った支援に感謝。

1。 HEK293レイヤーのトランスフェクション<ol><li> DMEM 500mlのボトル（4.5グラム/ mlのグルコースとフェノールレッドとし、グルタミンなし）に追加することによりHEK293細胞培地を準備：50ミリリットルFBS、5ミリリットル100Xペニシリン/ストレプトマイシン溶液、5ml 100倍のL-グルタミン溶液と500μlのアムホテリシンをB. </li><li>ウェル当たりHEK293 0.5mlのメディアを用いて24ウェルプレートでHEK293細?...

<ol>
	<li>Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+islet+structure+and+cellular+interactions+in+the+control+of+insulin+secretion.">Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion.</a> Islets. 3, 41-47 (2011).</li><li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets.">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129, 359-370 (2007).</li><li>Jain, R., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+the+endocrine+pancreas.">Cell-cell interactions in the endocrine pancreas.</a> Diabetes Obes. Metab. 11, 159-167 (2009).</li><li>Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-secreting+cell+lines:+classification,+characteristics+and+potential+applications.">Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications.</a> Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).</li><li>Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+build+a+central+synapse:+clues+from+cell+culture.">How to build a central synapse: clues from cell culture.</a> Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).</li><li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons.">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li><li>Abderrahmani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+traits+are+required+for+glucose-induced+insulin+secretion.">Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion.</a> FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).</li><li>Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+secretory+granules+and+neuronal+synaptic+vesicles+have+three+integral+membrane+proteins+in+common.">Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common.</a> The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).</li><li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neurexin,+neuroligin,+and+their+cytoplasmic+binding+partners+in+the+pancreatic+beta-cells+and+the+involvement+of+neuroligin+in+insulin+secretion.">Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion.</a> Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).</li><li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+neuroligin-2+interactions+enhance+insulin+secretion+and+are+integral+to+pancreatic+beta+cell+function.">Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).</li><li>Kohnert, K. D., Hehmke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+suspensions+of+pancreatic+islet+cells:+a+comparison+of+methods.">Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+I:+digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue.">Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue.</a> J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+II:+purification+and+culture+of+human+islets.">Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets.</a> J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+beta-cell-to-beta-cell+interactions+are+required+for+integrated+responses+to+nutrient+stimuli:+enhanced+Ca2++and+insulin+secretory+responses+of+MIN6+pseudoislets.">Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets.</a> Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).</li><li>Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superfusion+of+dissociated+pancreatic+islet+cells+attached+to+Cytodex+beads.">Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads.</a> Diabetes. 31, 189-193 (1982).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression+in+HEK293+cells:+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis.">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).</li><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+a+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).</li><li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages.">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).</li></ol>

共培養方法は、β-細胞表面の特異的膜貫通タンパク質の、特にその細胞外ドメインの生理学的重要性を決定するために効果的な方法を提供ここで説明する。細胞表面上の関心のあるタンパク質を表示するHEK293細胞と接触で培養β細胞又はインスリノーマ細胞（例えば、ここで用いINS-1細胞など）により、実験を直接妨げることなく、細胞外タンパク質 - タンパク質相互作用の効果を決定するよ...

ここでは、特定の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、インスリン分泌をどのように影響するかの調査を容易にする方法が記載されている。膵臓β-細胞表面上のタンパク質（あるいは他の分子）と目的のタンパク質との相互作用の影響方法プローブ。この方法は、ベータ細胞または他の隣接セル（ 例えば、内皮細胞、神経細胞、膵臓α細胞）によって発現細胞表面タンパク質は、細胞間の相互作用（ すなわち、隣接する表面上の相互作用パートナーとの相互作用を介し介しβ細胞機能にどのように影響するかの調査を可能にするβ細胞）。 細胞の形質膜は、細胞外環境へのブリッジとしての構造的および機能的タンパク質の複雑な配列が含まれています。経接続の形成によりまたはプラスチックシグナル伝達事象を開始することにより、細胞表面タンパク質間の相互作用は、コーディネートすることができ隣接セルの機能を有する。膵臓β細胞を膵島内にクラスタ化し、グルコース恒常性を維持するために、1協調して作用している。細胞外EPHA-ephrinAおよびグルコース刺激性インスリン分泌の調節におけるニューロリギン-2相互作用の重要性によって、例えば、明らかにし、それがますます明らかになってきている隣接表面にタンパク質との間に発生する相互作用の増大した細胞外知識ベータ細胞がインスリン分泌、β細胞機能の成熟と1-3グルコース恒常性の維持の完全な理解を得るための非常に重要になります。ここに記載された方法の目的は、特定の膜貫通または他の細胞表面結合タンパク質を含む経細胞相互作用のβ細胞機能への影響の調査を可能にすることである。異なる発現構築物でトランスフェクトしたHEK293細胞との共培養β細胞、Bの効果によって異なる細胞表面タンパク質または変異した変異体のイータ細胞機能としては、効率的に探査することができる。これは、β細胞自体をトランスフェクトすることなく達成される。 培養β細胞またはin vivoでノックダウン、ノックアウトまたは過剰発現の研究により、特定の経細胞相互作用の役割の解明は、潜在的の分析を混乱させることができる方法でβ細胞の健康及び/又は機能に影響を与え、β-細胞のmRNAおよびタンパク質の発現の直接的な摂動を必要とする特定の細胞外相互作用の効果。これらはまた、標的蛋白質の細胞内ドメインのレベルを変更し、さらに、経細胞間相互作用の影響を区別する上で、同じ細胞内のタンパク質間の相互作用による影響を許可しない近づく。ここでは、β細胞のインスリン分泌能力と応答上の特定の経細胞相互作用の効果を決定するための方法は、descrをあるアイベッド。この方法は、例えば、INS-1細胞4とインスリン分泌β-細胞株、および解離プライマリげっ歯類またはヒトβ細胞にも適用可能である。なお、HEK293（またはCOS）細胞層に発現して、特定の神経細胞のタンパク質に培養ニューロンの露出がドライブシナプス形成5,6というタンパク質を同定することができるが見つかりました神経生物学者、によって開発された共培養モデルに基づいています。神経シナプスのとβ細胞の分泌機構との間に類似点を考えると、我々は、β細胞機能を推論し、機能的成熟は、同様の経細胞の相互作用7-9によって駆動されることがあります。これらの相互作用を調査するために、我々は、β細胞が関心10のタンパク質を発現するHEK293細胞の層上に共培養された本明細書に記載のシステムを開発した。このシステムは、細胞外タンパク質 - タンパク質相互作用を操作しながらベータ細胞質をそのまま維持することができる。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA 3.3 vector/backbone</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K830001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18324012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-312</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep solution</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-652-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-808-1/30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-404</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-434</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-710-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell stripper</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45000-668</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>BD</td>
			<td>1368065</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-130</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879-100MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R0278</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture analysis of extracellular protein interactions affecting insulin secretion by pancreatic beta cells

細胞表面タンパク質間の相互作用は隣接セルの機能を調整するのに役立ちます。膵臓β細胞を膵島内にクラスタ化し、グルコース恒常性を維持するために調整された様式で作用している。これは、隣接したβ細胞表面の膜貫通タンパク質間の相互作用は、β細胞機能の重要な決定要因であることがますます明らかになりつつある。 培養β細胞またはin vivoでノックダウン、ノックアウトまたは過剰発現の研究により、特定の経細胞相互作用の役割の解明は、潜在的影響の分析を混乱させることができる方法でβ-細胞の健康及び/又は機能に影響を与え、mRNAおよびタンパク質の発現の直接的な摂動を必要とする具体的な相互作用の。これらはまた、標的蛋白質の細胞内ドメインのレベルを変更し、DISであることが同じ細胞膜内のタンパク質間の相互作用による影響を防ぐことが近づく経細胞の相互作用の影響からtinguished。 ここでβ細胞のインスリン分泌能力と応答上の特定の経細胞相互作用の効果を決定するための方法が提示される。この方法は、例えば、INS-1細胞などのベータ細胞株、および解離プライマリβ細胞にも適用可能である。それはシナプス形成を駆動するための重要なタンパク質を同定したHEK293（またはCOS）細胞層に発現して、特定の神経細胞のタンパク質への培養神経細胞のその露出を発見した神経生物学者が開発した共培養モデルに基づいています。神経シナプスのとβ細胞の分泌機構との間に類似点を考えると、我々はβ細胞機能の成熟は、同様の経細胞の相互作用によって駆動されるかもしれないと考えた。我々は、β細胞は、目的のタンパク質を発現するHEK293細胞層上で培養されたシステムを開発した。このモデルでは、β-細胞の細胞質は、細胞外タンパク質interactioながらそのままですNSは、操作されます。我々は、主にグルコース刺激性インスリン分泌の研究に焦点を当てているが、ここで、他のプロセスを解析することができ、例えば、遺伝子発現の変化は、免疫ブロット法または定量PCRによって決定される。

メソッドを使用してここで説明する、私たちは、インスリン分泌にプロテインニューロリギンの異なる亜種の効果をテストしました。これは、β細胞機能10上ニューロリギン-2の効果を調査我々の公開されて仕事を補完する。 図2は、例えば、ここで呼ばれるニューロリギンアイソフォームを発現するようトランスフェクトHEK293細胞と共培養するINS-1ベータ細胞から得られ?...

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Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

経細胞タンパク質相互作用は、膵臓β-細胞機能の重要な決定因子である。法適応特定貫通タンパク質がインスリン分泌にどのように影響するかを調査するためのシナプス-の共培養モデルからは、ここで詳しく説明します。トランスフェクトしたHEK293細胞は、目的のタンパク質を発現し、β細胞は、トランスフェクションまたは他の方法で直接摂動する必要はありません。

膵β細胞によるインスリン分泌に影響を及ぼす細胞外タンパク質相互作用の共培養分析

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Improving IV Insulin Administration in a Community Hospital

コミュニティ病院でIVのインスリン投与を向上させる

Diabetes mellitus is a major independent risk factor for increased morbidity and mortality in the hospitalized patient, and elevated blood glucose ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

器官型脳スライスと癌細胞の3Dスフェロイドとの共培養システム

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

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人間デュピュイトラン<em&gt;エクスビボ</em筋線維芽細胞と細胞外マトリックス相互作用の研究のために&gt;文化

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps

慢性アミロイドβオリゴマー輸液の動物モデルにおける神経変性は、浸透圧ポンプを用いて抗体治療フューズによって打ち消されます

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

ロボット中央膵の吻合をエンド ツー エンドのアプリケーション

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Homogeneous Time-resolved FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

均質な時間分解蛍光共鳴エネルギー転送を用いた測定インスリン分泌の検出

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

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カンジダを使用してリアルタイム細胞フラックス解析のバイオ エネルギー調査

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...