Name: coculture analysis of extracellular protein interactions affecting insulin secretion by pancreatic beta cells
Uploaded: 2013-06-15T14:00:00
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이 작품은 건강 보조금 R01DK080971 및 청소년 당뇨병 연구 재단 보조금 37-2009-44의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 UCSD 소아 당뇨병 연구 센터 (PDRC)로부터받은 지원도 주셔서 감사합니다.

1. HEK293 레이어의 형질 전환 <ol><li> 50 ML FBS 5 ML 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션 5 ML 100X L-글루타민 용액 500 μL 암포 테리 신 : DMEM의 500 ML 병 (4.5 g / ML 포도당과 페놀 레드와 글루타민이없는)에 추가하여 HEK293 세포 매체를 준비합니다 B. </li><li> 물론 당 HEK293 매체의 0.5 ML를 사용하여 24 - 웰 플레이트에 HEK293 세포 밖으로 접시. 세포가 플레이트의 하단에 균등하게 분산되어 있는지 확인합니다....

<ol>
	<li>Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+islet+structure+and+cellular+interactions+in+the+control+of+insulin+secretion.">Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion.</a> Islets. 3, 41-47 (2011).</li><li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets.">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129, 359-370 (2007).</li><li>Jain, R., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+the+endocrine+pancreas.">Cell-cell interactions in the endocrine pancreas.</a> Diabetes Obes. Metab. 11, 159-167 (2009).</li><li>Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-secreting+cell+lines:+classification,+characteristics+and+potential+applications.">Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications.</a> Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).</li><li>Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+build+a+central+synapse:+clues+from+cell+culture.">How to build a central synapse: clues from cell culture.</a> Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).</li><li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons.">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li><li>Abderrahmani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+traits+are+required+for+glucose-induced+insulin+secretion.">Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion.</a> FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).</li><li>Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+secretory+granules+and+neuronal+synaptic+vesicles+have+three+integral+membrane+proteins+in+common.">Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common.</a> The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).</li><li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neurexin,+neuroligin,+and+their+cytoplasmic+binding+partners+in+the+pancreatic+beta-cells+and+the+involvement+of+neuroligin+in+insulin+secretion.">Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion.</a> Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).</li><li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+neuroligin-2+interactions+enhance+insulin+secretion+and+are+integral+to+pancreatic+beta+cell+function.">Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).</li><li>Kohnert, K. D., Hehmke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+suspensions+of+pancreatic+islet+cells:+a+comparison+of+methods.">Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+I:+digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue.">Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue.</a> J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+II:+purification+and+culture+of+human+islets.">Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets.</a> J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+beta-cell-to-beta-cell+interactions+are+required+for+integrated+responses+to+nutrient+stimuli:+enhanced+Ca2++and+insulin+secretory+responses+of+MIN6+pseudoislets.">Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets.</a> Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).</li><li>Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superfusion+of+dissociated+pancreatic+islet+cells+attached+to+Cytodex+beads.">Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads.</a> Diabetes. 31, 189-193 (1982).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression+in+HEK293+cells:+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis.">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).</li><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+a+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).</li><li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages.">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).</li></ol>

여기에 설명 된 배양 방법은 특정 베타 세포 표면 막 단백질의 생리적 중요성을 확인하는 효과적인 방법을 제공합니다, 특히 자신의 세포 도메인으로. 세포 표면에 대한이자의 단백질을 표시하는 HEK293 세포와 접촉 배양 베타 세포 또는 인슐린 종 세포 (예 : 여기에 사용 된 INS-1 세포)에 의해 실험을 직접 방해하지 않고 세포 단백질 - 단백질 상호 작용의 효과를 결정하기 위하여 디자인 될 수있다 ?...

우리는 여기에서 특정 막 단백질의 세포 외 도메인이 인슐린 분비에 영향을 미치는 방법 연구를 촉진하는 방법을 설명합니다. 췌장 베타 세포의 표면에 단백질 (또는 다른 분자)와 관심의 단백질의 상호 작용의 방법 프로브는 효과. 방법은 베타 세포 또는 다른 이웃 세포 ​​(예 : 내피 세포, 신경 세포, 췌장 알파 세포)에 의해 표현 세포 표면 단백질 transcellular 상호 작용 (즉, 인접한 표면에 상호 작용 파트너와의 상호 작용을 통해 통해 베타 세포 기능에 영향을 어떻게 조사 할 수 있습니다 베타 세포). 세포의 세포막은 세포 외 환경에 교량 역할을 구조적, 기능적 단백질의 복잡한 배열을 포함하고 있습니다. transcellular 연결의 형성에 의해 또는 플라스틱 신호 이벤트의 개시에 의해, 세포 표면 단백질 간의 상호 작용을 조정할 수 있습니다이웃 세포의 기능. 췌장 베타 세포는 췌장 내에서 함께 클러스터링과 포도당 항상성 1을 유지하기 위해 조정 방식으로 작동합니다. 로 세포 EphA-ephrinA과 포도당 자극 인슐린 분비의 조절에 neuroligin-2 상호 작용의 중요성에 의해, 예를 들어, 공개, 그것은 점점 더 분명 해지고있다 그 인접의 표면에 단백질 사이에서 발생하는 세포 상호 작용의 지식 증가 베타 세포는 인슐린 분비, 베타 세포 기능의 성숙과 1-3 포도당 항상성의 유지 완전한 이해를 얻기위한 중요성 될 것입니다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 특정 횡단하거나 세포 표면과 연관된 단백질을 포함 transcellular 상호 작용의 베타 세포의 기능에 미치는 영향의 조사를 가능하게하는 것입니다. 다른 식 구조로 형질 HEK293 세포, B에 대한 효과와 공동 배양 (co-culture)의 베타 세포에 의해다른 세포 표면 단백질 또는 돌연변이 변종 ETA 세포의 기능은 그 효율적으로 탐색 할 수 있습니다. 이 베타 세포 자체를 형질하지 않고도 수행 할 수 있습니다. 배양 된 베타 세포 또는 생체 내에서 최저 녹아웃 또는 발현 연구에 의해 특정 transcellular 상호 작용의 역할의 해명은 잠재적으로 분석을 혼동 수있는 방법으로 베타 세포의 건강 및 / 또는 기능에 영향을 미치는 베타 세포의 mRNA와 단백질 발현을 직접 섭동을 필요로 특정 세포 상호 작용의 효과. 이들은 또한 타겟 단백질의 세포 내 도메인 수준을 변경하고, 추가, transcellular 상호 작용의 효과를 구별 할 수 또는 동일한 셀에있는 단백질 사이의 상호 작용에 의해 영향을 허용하지 않는 접근한다. 여기에 베타 세포의 인슐린 분비 능력 및 응답의 특정 transcellular 상호 작용의 효과를 결정하기위한 방법은 DESCR입니다IBED. 이 방법은 INS-1 세포를 4로 인슐린을 분비하는 베타 세포 라인에 그리고 해리 기본 짐승이나 인간의 베타 세포에 적용 할 수 있습니다. 그것은 HEK293 (또는 COS) 세포 레이어에 표현 된 특정 신경 세포의 단백질 배양 신경 세포의 노출을 발견 신경 생물 학자에 의해 개발 된 배양 모델을 기반으로 해당 드라이브의 시냅스 형성 5,6 단백질을 확인할 수 있습니다. 시냅스의 분비 기계 사이의 베타 세포의 평행선을 감안할 때, 우리는 베타 세포 기능과 기능 성숙 유사 transcellular 상호 작용 7-9에 의해 구동 될 수 있다는 추론. 이러한 상호 작용을 조사하기 위해, 우리는 베타 세포가 그 10의 단백질을 발현하는 HEK293 세포의 레이어에 동시 배양되는 문서에 설명 된 시스템을 개발했다. 이 시스템은 세포 단백질 - 단백질 상호 작용을 조작하는 동안 베타 세포의 세포질을 그대로 유지 할 수 있습니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA 3.3 vector/backbone</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K830001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18324012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-312</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep solution</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-652-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-808-1/30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-404</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-434</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-710-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell stripper</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45000-668</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>BD</td>
			<td>1368065</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-130</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879-100MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R0278</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture analysis of extracellular protein interactions affecting insulin secretion by pancreatic beta cells

세포 표면 단백질 사이의 상호 작용은 이웃 세포의 기능을 조정하는 데 도움이. 췌장 베타 세포는 췌장 내에서 함께 클러스터링과 포도당 항상성을 유지하기 위해 조정 방식으로 작동합니다. 그것은 인접 베타 세포의 표면에있는 막 단백질 사이의 상호 작용이 베타 세포 기능의 중요한 결정 요인임을 점점 더 분명 해지고있다. 배양 된 베타 세포 또는 생체 내에서 최저 녹아웃 또는 발현 연구에 의해 특정 transcellular 상호 작용의 역할의 해명은 잠재적 효과 분석을 혼동 수있는 방법으로 베타 세포의 건강 및 / 또는 기능에 영향을 미치는 발현 및 단백질 발현의 직접 섭동을 필요로 특정 상호 작용. 이러한 방법은 타겟 단백질의 세포 내 도메인 수준을 변경하고 표시 할 같은 세포막에서 단백질 사이의 상호 작용에 의한 영향을 방지 할 수 있습니다transcellular 상호 작용의 영향에서 tinguished. 여기에 베타 세포의 인슐린 분비 능력 및 응답의 특정 transcellular 상호 작용의 효과를 결정하기위한 방법이 제공됩니다. 이 방법은 INS-1 세포와 같은 베타 세포 라인에 그리고 해리 차 베타 세포에 적용 할 수 있습니다. 그것은 HEK293 (또는 COS) 시냅스 형성을 구동하기위한 중요한 세포층 확인 된 단백질의 발현 특정 신경 세포의 단백질 배양 신경 세포의 노출을 발견 신경 생물 학자에 의해 개발 된 배양 모델을 기반으로합니다. 시냅스의 베타 세포의 분비 기계 사이의 평행선을 감안할 때, 우리는 베타 세포 기능의 성숙 유사 transcellular 상호 작용에 의해 구동 될 수 있다는 추론. 우리는 베타 세포가 관심의 단백질을 발현하는 HEK293 세포의 레이어에 배양 시스템을 개발했다. 이 모델에서 베타 세포의 세포질은 그대로되어 세포 단백질 - 단백질 자원 활용하면서NS는 조작된다. 우리는 주로 포도당 자극 인슐린 분비의 연구에 여기에 초점을하지만, 다른 프로세스를 분석 할 수 있으며, 예를 들면, 유전자 발현의 변화로 immunoblotting을 또는 qPCR에 의해 결정됩니다.

방법을 사용하여 여기에 설명 된, 우리는 인슐린 분비 단백질 neuroligin의 다른 변형의 효과를 시험했다. 이 베타 세포 기능 10 neuroligin-2의 효과를 조사하는 우리의 게시 된 작품을 보완한다. 그림 2 예를 들어, 여기에 언급 neuroligin 이소을 표현 형질 HEK293 세포 coculturing의 INS-1 베타 세포에서 얻은 결과를 보여 NL- X. 이 실험은 NL-X는 인슐린 분비를 증가시키는 transcellular 상호 작용?...

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Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Transcellular 단백질 상호 작용은 췌장 베타 세포 기능의 중요한 결정 요인이다. 여기에 자세한 방법을 적응 특정 막 단백질은 인슐린 분비에 영향을 미치는 방법을 조사 시냅스 - 용의 배양 모델에서. 형질 HEK293 세포는 그 단백질을 표현, 베타 세포는 형질 전환하거나 직접 교란 할 필요가 없습니다.

췌장의 베타 세포가 인슐린 분비에 영향을 미치는 세포 외 단백질 상호 작용의 배양 분석

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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의학

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Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

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