Name: coculture analysis of extracellular protein interactions affecting insulin secretion by pancreatic beta cells
Uploaded: 2013-06-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells at JoVE.com

Эта работа выполнена при поддержке Национального института здоровья грант R01DK080971 и детского диабета исследовательский грант Фонда 37-2009-44. Мы также высоко ценим поддержку, полученную от UCSD детского диабета исследовательский центр (PDRC).

1. Трансфекцию HEK293 слоя <ol><li> Подготовка HEK293 клеточной среде путем добавления к 500 мл бутылки DMEM (с 4,5 г / мл глюкозы и фенол красный и без глутамина): 50 мл ФБС, 5 мл 100X раствор пенициллина / стрептомицина, 5 мл 100x L-глутамина раствора и 500 мкл амфотерицин B. </li><li> Пластина из клеток НЕК293 в 24-луноч...

<ol>
	<li>Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+islet+structure+and+cellular+interactions+in+the+control+of+insulin+secretion.">Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion.</a> Islets. 3, 41-47 (2011).</li><li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets.">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129, 359-370 (2007).</li><li>Jain, R., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+the+endocrine+pancreas.">Cell-cell interactions in the endocrine pancreas.</a> Diabetes Obes. Metab. 11, 159-167 (2009).</li><li>Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-secreting+cell+lines:+classification,+characteristics+and+potential+applications.">Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications.</a> Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).</li><li>Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+build+a+central+synapse:+clues+from+cell+culture.">How to build a central synapse: clues from cell culture.</a> Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).</li><li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons.">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li><li>Abderrahmani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+traits+are+required+for+glucose-induced+insulin+secretion.">Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion.</a> FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).</li><li>Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+secretory+granules+and+neuronal+synaptic+vesicles+have+three+integral+membrane+proteins+in+common.">Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common.</a> The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).</li><li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neurexin,+neuroligin,+and+their+cytoplasmic+binding+partners+in+the+pancreatic+beta-cells+and+the+involvement+of+neuroligin+in+insulin+secretion.">Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion.</a> Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).</li><li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+neuroligin-2+interactions+enhance+insulin+secretion+and+are+integral+to+pancreatic+beta+cell+function.">Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).</li><li>Kohnert, K. D., Hehmke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+suspensions+of+pancreatic+islet+cells:+a+comparison+of+methods.">Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+I:+digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue.">Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue.</a> J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+II:+purification+and+culture+of+human+islets.">Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets.</a> J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+beta-cell-to-beta-cell+interactions+are+required+for+integrated+responses+to+nutrient+stimuli:+enhanced+Ca2++and+insulin+secretory+responses+of+MIN6+pseudoislets.">Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets.</a> Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).</li><li>Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superfusion+of+dissociated+pancreatic+islet+cells+attached+to+Cytodex+beads.">Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads.</a> Diabetes. 31, 189-193 (1982).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression+in+HEK293+cells:+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis.">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).</li><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+a+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).</li><li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages.">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).</li></ol>

Совместное культивирование Описанный здесь метод обеспечивает эффективный способ, чтобы определить физиологическое значение конкретных бета-клеточной поверхности, трансмембранные белки, в частности их внеклеточных доменов. При культивировании бета-клетки или клетки инсулиномы (на...

Здесь описан способ для облегчения исследования как внеклеточные домены конкретных трансмембранные белки влияют на секрецию инсулина. Метод зондов эффекты взаимодействия белка, представляющего интерес с белками (или, возможно, другие молекулы) в панкреатических бета-клеток поверхности. Метод позволяет исследований того, как на поверхности клеток белков, экспрессируемых бета-клетками или другими соседними клетками (например, эндотелиальные клетки, нейроны, клетки панкреатической альфа) влияет на бета-клеток через трансцеллюлярного взаимодействия (т.е. через взаимодействие с партнерами взаимодействие на поверхности соседних бета-клеток). Клеточной мембраны плазма содержит сложный комплекс структурных и функциональных белков, выступающая в качестве мостов с внеклеточной средой. По формированию трансцеллюлярному соединения или инициированием пластиковых сигнальных событий, взаимодействия между белков клеточной поверхности может помочь координироватьФункция соседних ячеек. Панкреатических бета-клетках сгруппированы вместе в панкреатических островках и действовать согласованно для поддержания гомеостаза глюкозы 1. Как показал, например, по важности внеклеточного EphA-ephrinA и нейролигина-2 взаимодействий в регуляции глюкозо-стимулированной секреции инсулина, становится все более ясно, что повышение уровня знаний внеклеточной взаимодействия, происходящие между белками на поверхности соседних бета-клетки будут иметь большое значение для получения полного представления о секреции инсулина бета-клетки функционального созревания и поддержания гомеостаза глюкозы 1-3. Цель метода, описанного здесь, чтобы исследования влияния на функцию бета-клетки трансцеллюлярного взаимодействий с конкретными трансмембранной или иным-клеточной поверхности, белки, ассоциированные. При совместном культивировании с бета-клеток НЕК293 клетках, трансфицированных различные экспрессирующие конструкции, воздействие на бэта-клеточной функции различных белков клеточной поверхности или мутированные варианты могут быть эффективно исследовали. Это достигается без трансфекции бета самих клеток. Выяснение роли, особенно трансцеллюлярному взаимодействий нокдаун, нокаут или избыточной экспрессии исследования в культуре клеток бета-или в естественных условиях требует прямого возмущения бета-клеток мРНК и белка выражение, могут повлиять на здоровье бета клеток и / или функции способами, которые могут посрамить анализы влияние конкретных внеклеточный взаимодействий. Эти подходы также изменить уровней внутриклеточных доменов целевых белков и, кроме того, не позволяют эффектов из-за взаимодействия между белками или в той же камере следует отличать от последствий трансцеллюлярного взаимодействий. Здесь описан способ определения влияния конкретных трансцеллюлярного взаимодействий на способность секретирующих инсулин и оперативность бета-клеток является описание экспозицийIBED. Этот способ применим к секретирующих инсулин бета-клеток линий, таких как INS-1 клетки 4 и диссоциированной первичный грызуна или человека бета-клеток. Он основан на совместное культивирование модели, разработанные нейробиологов, которые обнаружили, что воздействие культивируемых нейронов конкретных нейронов белки экспрессируются на HEK293 (или COS) слоев клеток могли идентифицировать белки, которые привод формирование синапсов 5,6. Учитывая параллели между секреторной техники нейронных синапсов и бета-клеток, мы рассуждали, что бета-клеток и функциональное созревание может быть обусловлен подобный трансцеллюлярному взаимодействий 7-9. Для того чтобы исследовать эти взаимодействия, мы разработали систему, описанную здесь, в котором бета-клетки совместно культивировали на слой клеток НЕК293, экспрессирующие белок 10. Эта система позволяет бета-клеток цитоплазма остается нетронутой в то время как внеклеточный белок-белковых взаимодействий манипулируют.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA 3.3 vector/backbone</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K830001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18324012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-312</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep solution</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-652-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-808-1/30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-404</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-434</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-710-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell stripper</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45000-668</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>BD</td>
			<td>1368065</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-130</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879-100MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R0278</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture analysis of extracellular protein interactions affecting insulin secretion by pancreatic beta cells

Взаимодействие белков клеточной поверхности помогать координировать функции соседних ячеек. Панкреатические бета-клетки группируются вместе в панкреатических островках и действовать согласованно для поддержания гомеостаза глюкозы. Становится все более ясно, что взаимодействие между трансмембранных белков на поверхности соседней бета-клетки являются важными детерминантами бета-клеток. Выяснение роли, особенно трансцеллюлярному взаимодействий нокдаун, нокаут или избыточной экспрессии исследования в культуре клеток бета-или в естественных условиях требует прямого возмущения мРНК и белка выражения, которые могут повлиять бета-клеток здоровью и / или функции способами, которые могут посрамить анализов влияния специфических взаимодействий. Эти подходы также изменить уровни внутриклеточные домены целевых белков и может предотвратить эффекты вследствие взаимодействия между белками в пределах одной клеточной мембраны быть дисплееотмеченной от воздействия трансцеллюлярного взаимодействий. Здесь способ для определения влияния конкретных трансцеллюлярного взаимодействий на способность секретирующих инсулин и оперативность бета-клеток представлена. Этот способ применим к бета-клеточных линий, например, INS-1 клетками, а также диссоциированных первичной бета-клеток. Он основан на совместное культивирование модели, разработанные нейробиологов, которые обнаружили, что воздействие культивируемых нейронов конкретных нейронов белки экспрессируются на HEK293 (или COS) слоев клеток идентифицированных белков важна для вождения формирование синапсов. Учитывая параллели между секреторной техники нейронных синапсов и бета-клеток, мы рассуждали, что бета-клетки функциональное созревание может быть обусловлен подобный трансцеллюлярному взаимодействий. Мы разработали систему, в которой бета-клетки культивируют на слое НЕК293 клетках, экспрессирующих белок, представляющий интерес. В этой модели, бета-клеток цитоплазма затрагивается при внеклеточный белок-белковых ВЗАИМОДЕЙСТВИЕнс манипулируют. Хотя здесь мы сосредоточены в основном на исследованиях глюкозо-стимулированной секреции инсулина, другие процессы могут быть проанализированы, например, изменения в экспрессии генов, как определено с помощью иммуноблоттинга или количественной ПЦР.

С помощью способа, описанного здесь, мы тестировали эффект различных вариантов белка нейролигина на секрецию инсулина. Это дополняет нашей опубликованной работе исследования влияния нейролигина-2 на бета-клеток 10. Рисунке 2, например, изображает результаты, полученные и...

Watch this Scientific Journal Video about Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells at JoVE.com

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Трансцеллюлярному взаимодействий белка являются важными факторами, определяющими панкреатических бета-клеток. Общий Вот метод, адаптированный из сокультивирования модель синаптогенезе-исследования, как конкретные трансмембранных белков влияют секрецию инсулина. Трансфицированных клеток НЕК293 выразить интерес белков, бета-клетки не нужны для трансфекции или иным образом непосредственно возмущенных.

Coculture Анализ внеклеточных белковых взаимодействий влияющие секрецию инсулина клетками поджелудочной железы бета

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Improving IV Insulin Administration in a Community Hospital

Улучшение IV введения инсулина в Коммьюнити

Diabetes mellitus is a major independent risk factor for increased morbidity and mortality in the hospitalized patient, and elevated blood glucose ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Выделение, характеристика и сравнительный Дифференциация по правам зубных стволовых клеток, полученных из целлюлозы постоянных зубов с помощью двух различных методов

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Сокультивирования система с Органотипической мозга Slice и 3D Сфероид клеток карциномы

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Человек Дюпюитрена<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Культура по изучению Миофибробласты и внеклеточный матрикс взаимодействий

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Изучение рака поджелудочной железы стволовых клеток Характеристики для разработки новых стратегий лечения

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps

Нейродегенерации в животной модели хронического амилоид-бета олигомера Infusion нейтрализуется антителами Лечение пронизаны осмотические насосы

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Применение анастомоза конец в конец в роботизированной Центральной Панкреатэктомия

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Homogeneous Time-resolved FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Однородное время решены Фёрстер резонанс энергии на основе передачи Assay для обнаружения секреции инсулина

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Изоляция первичного мыши гепатоцитов для зарождающейся белка синтез анализа методом маркировки нерадиоактивные L-azidohomoalanine

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Биоэнергетика расследование Candida albicans с помощью реального времени внеклеточного потока анализа

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...