Name: culturing primary rat inner medullary collecting duct cells
Uploaded: 2013-06-21T14:00:00
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Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (; KL 1415/3-2 und KL 1415/4-2 DFG) unterstützt.

1. Vorbereitung <ol><li> Vorbereitung der Kulturschalen <ol><li> Thaw Kollagen Typ IV O / N bei 4 ° C und löst ihn in 0,1% sterile Essigsäure. Das Volumen zu verwenden, hängt von der Art und Anzahl der Gerichte, in denen die Zellen ausgesät zu werden. Verwenden 2 pg / cm 2. </li><li> Inkubieren Gerichte mindestens 1 h bei RT und waschen zweimal mit destilliertem Wasser (A. tridest). </li><li> Lassen Sie die Gerichte, um richtig zu trocknen. </li></ol></li><li> Supplementation des Mediums <ol><li> Erhö...

<ol>
	<li>Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+mouse+cortical+collecting+duct+cell+line.">Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line.</a> Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).</li><li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. 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Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).</li><li>Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-2+expression+in+primary+cultured+rat+inner+medullary+collecting+duct+cells.">Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells.</a> Am. J. 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Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).</li><li>Maric, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+volume+kinetics+of+adherent+epithelial+cells+measured+by+laser+scanning+reflection+microscopy:+determination+of+water+permeability+changes+of+renal+principal+cells.">Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells.</a> Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).</li><li>Gonzalez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+stimulates+renin+in+inner+medullary+collecting+duct+cells+via+protein+kinase+C+and+independent+of+epithelial+sodium+channel+and+mineralocorticoid+receptor+activity.">Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity.</a> Hypertension. 57, 594-599 (2011).</li><li>Chou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+aquaporin-2+trafficking+by+vasopressin+in+the+renal+collecting+duct.+Roles+of+ryanodine-sensitive+Ca2++stores+and+calmodulin.">Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).</li><li>Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+native+inner+medullary+collecting+duct+cells+from+rat+kidney.">Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney.</a> Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).</li><li>Tchapyjnikov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+nuclei+from+native+renal+inner+medullary+collecting+duct+cells+using+LC-MS/MS.">Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS.</a> Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).</li><li>Stefan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+cAMP-dependent+signaling+by+phosphodiesterase-4D+is+involved+in+the+regulation+of+vasopressin-mediated+water+reabsorption+in+renal+principal+cells.">Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).</li><li>Klussmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inhibitory+role+of+Rho+in+the+vasopressin-mediated+translocation+of+aquaporin-2+into+cell+membranes+of+renal+principal+cells.">An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells.</a> J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).</li></ol>

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung und Kultivierung von primären Ratten IMCD Zellen. Der Ansatz liefert bis zu 21 cm 2 von Zellen aus einer Ratte 20. Der Versuch erfordert Standard Zellkulturausrüstung und kann von einer einzigen Person innerhalb von etwa 6 Stunden durchgeführt werden. Daher ist dieser Ansatz eignet sich als Standard-Labormethode. Primäre Ratte IMCD Zellen in Kulturschalen unterschiedlicher Größe ausgesät werden, ...

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Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

In renalen Sammelkanal Hauptzellen steuert Arginin-Vasopressin (AVP) Reabsorption von Wasser durch die Stimulierung der Insertion des Wassers Aquaporin-2 (AQP2) in die Plasmamembran. AVP bindet an das G-Protein-gekoppelten Vasopressin-Typ-2-Rezeptor (V2R) stimuliert Adenylatcyclase und somit cAMP-Bildung. Initiation dieser Signalkaskade führt zur Aktivierung der Proteinkinase A (PKA). PKA phosphoryliert AQP2 an Serin 256 (S256), das ist der Schlüssel Auslöser für seine Umverteilung von intrazellulären Vesikeln in die Plasmamembran. Die Membran Einsetzen erleichtert Wasserreabsorption entlang eines osmotischen Gradienten und Feinabstimmung Körper Wasser-Homöostase. Dysregulation der AVP-vermittelten Wasserreabsorption aufgrund Aberrationen AVP-Sekretion oder AVP-aktivierten Signalisierung Ursachen oder ist mit schweren Erkrankungen. Verminderte Wasserreabsorption durch Mutationen des V2R oder AQP2 verursacht führt zu Diabetes insipidus, während eine elevATED Blutplasma AVP Ebene wird mit überschüssigem Wasser Reabsorption in Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie chronischer Herzinsuffizienz und das Syndrom der inadäquaten ADH-Sekretion (SIADH) verbunden. Die Bedeutung der AVP-vermittelten Wasserreabsorption rührt nicht nur von seiner Verwicklung in Krankheit. Die AVP-induzierte Translokation von AQP2-tragenden Vesikeln und Fusion mit der Zellmembran eine streng cAMP-abhängige Exozytose-Verfahren, die gegenwärtig nicht gut verstanden. Weitere Beispiele für eine cAMP-abhängige Exozytose Reninsekretion in der Niere und der H +-Sekretion in den Magen. Daher Aufklärung der molekularen Mechanismen für die AQP2-Translokation in renalen Hauptzellen hilft nicht nur ähnliche molekulare Prozesse in anderen Zelltypen zu verstehen, sondern kann auch den Weg zu neuen Therapien für die Behandlung von Erkrankungen, die mit Störungen der AVP-vermittelten Wasserreabsorption verbunden . Elucidating Kontrollmechanismen AQP2 erfordert Sammelkanal Hauptzellen Modelle. Hierzu wird eine Anzahl von verschiedenen Säugetierniere Zelllinien sind. Jedoch haben diese Modelle mehrere Nachteile. In vielen Zellsysteme der Protein-Ebene von AQP2 niedrig ist (Tabelle 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, andere ektopisch überexprimieren human (MCD4, WT10) 11,12 oder Ratte (CD8) 13 AQP2. In MCD4 und COS-7-Zellen, die V2-Rezeptor nicht exprimiert. Nach unserer Kenntnis gibt es keine permanente Zelllinie als Modell zur Verfügung, die von der Nierenfunktion inneren medullären Sammelkanal, dass ein Teil der Niere, wo AQP2 Expression häufigste abgeleitet ist, sondern von der kortikalen Sammelkanal 1,11,13-16 . Solche Zelle Modelle sind zum Beispiel das weit verbreitete verewigt mpkCCD (zB 17) oder die neu gegründete mTERT-CCD 14 Zelllinien. Beide Zelllinien endogen express AQP2 und V2R aber da sie aus der abgeleitetenkortikalen Sammelkanal wahrscheinlich eine unterschiedliche Proteom gegenüber inneren medullären Sammelkanal (IMCD-Zellen). Sie müssen zum Beispiel auszudrücken verschiedenen Na +-Transport-Systeme. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Kultur primären IMCD Zellen V2R und AQP2 endogen. Dieses Modell stellt daher am ehesten die physiologische Situation in der Nieren-Sammelkanal. Da die Gründung der Kultur erfordert nur Standard Laborgeräte anderen Laboratorien können leicht annehmen diesen Ansatz.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company Catalog</td>
			<td>Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type IV Mouse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356233</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H6254</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type CLS-II</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>C2-22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutMAX</td>
			<td>Invitrogen GIBCO</td>
			<td>21885108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>N4014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultroser G</td>
			<td>Cytogen</td>
			<td>15950-017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential amino acids (NEA)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>K0293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Invitrogen GIBCO</td>
			<td>15710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBcAMP</td>
			<td>BIOLOG</td>
			<td>D009</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing primary rat inner medullary collecting duct cells

Arginin-Vasopressin (AVP) erleichtert Wasserreabsorption durch renale Sammelkanal Hauptzellen und damit eine Feinabstimmung Körper Wasser-Homöostase. AVP bindet Vasopressin V2-Rezeptoren (V2R) auf der Oberfläche der Zellen und induziert dadurch Synthese von cAMP. Dies stimuliert die zelluläre Signalgebung Prozesse, die zu Veränderungen in der Phosphorylierung des Wassers Aquaporin-2 (AQP2). Protein Kinase A phoshorylates AQP2 und löst dadurch die Translokation von intrazellulären Vesikeln AQP2 in die Plasmamembran zu erleichtern Reabsorption von Wasser aus primären Urin. Aberrationen der AVP-Freisetzung aus der Hypophyse oder AVP-aktivierten Signalisierung in Hauptzellen kann zentral oder Diabetes insipidus sind; eine erhöhte Blutplasma AVP Ebene ist mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie chronischer Herzinsuffizienz und das Syndrom der inadäquaten ADH-Sekretion verbunden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für cultivatiauf der primären Ratten inneren medullären Sammelkanal (IMCD-Zellen), die ausdrückliche V2R und AQP2 endogen. Die Zellen eignen sich zur Erläuterung molekularen Mechanismen, die der Steuerung der AQP2 und damit Entwicklung neuer Medikamente zur Behandlung von Erkrankungen mit der Fehlregulation der AVP-vermittelten Wasserreabsorption verbunden zu entdecken. IMCD Zellen aus Ratte renale inneren medullae erhalten und werden für Experimente sechs bis acht Tage nach der Aussaat verwendet. IMCD Zellen in regelmäßigen Zellkulturschalen, Flaschen und Mikrotiterplatten unterschiedlicher Formate können kultiviert werden, das Verfahren erfordert nur ein paar Stunden, und ist geeignet für Standard Zellkulturlaboren.

Die erfolgreiche Kultivierung von primären Ratten IMCD-Zellen werden in einem Monolayer 6-8 Tage nach der Aussaat (Abbildung 2) führen. Per 60 mm Kulturschale gibt es etwa 6 x 10 6 Zellen. Die Zellen eng an den Kulturschalen haften, da diese mit Kollagen Typ IV, eine Basalmembran Komponente 18 beschichtet wurden. Daher wird IMCD Zellen nicht einmal lösen während mehrerer gründliches Waschen Verfahren. Bis zu 80% der kultivierten Zellen exprimieren endogen V2R und AQP2. Dies si...

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Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Arginin-Vasopressin (AVP) steuert Feinabstimmung der Körper Wasser Homöostase durch die Erleichterung Wasserreabsorption durch renale Hauptzellen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Kultivierung von primären Ratten inneren medullären Sammelkanal Zellen geeignet für die Aufklärung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen AVP-vermittelten Wasserreabsorption.

Kultivierung primären Ratten Inner Medulläre Sammelkanal Cells

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Research

JoVE Journal

Biology

Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds 

Sammeln und Messen Nozizeptive und Entzündungsmediatoren in chirurgische Wunden

We describe a methodology by which we are able to collect and measure inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical wound site. ...

Forschung

Biologie

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia SCG

Protokoll zur Kultivierung sympathischen Neuronen aus Ratten-Superior Halsganglien (SCG)

The superior cervical ganglia (SCG) in rats are small, glossy, almond-shaped structures that contain sympathetic neurons.  These neurons provide ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Primäre Kultur der erwachsenen Ratte Herz Myozyten

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primären humanen bronchialen Epithelzellen aus Explantaten Grown

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Isolierung von Basalzellen und Submuköse Gland Duct Zellen aus Maus Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

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Isolierung von Immunzellen aus Primärtumoren

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Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Die Kultivierung der menschlichen Nasen Epithelzellen an der Air flüssig-Grenzfläche

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A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

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Ein Verfahren zur Kultivierung von embryonalen<em&gt; C. elegans</em&gt; Zellen

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...