Name: culturing primary rat inner medullary collecting duct cells
Uploaded: 2013-06-21T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, KL e KL 1415/3-2 1415/4-2).

1. Preparação <ol><li> Preparar os pratos de cultura <ol><li> Descongelar colagénio Tipo IV O / N a 4 ° C e dissolvem-se em 0,1% de ácido acético estéril. O volume a ser usado depende do tipo e número de pratos em que as células estão a ser semeadas. Use 2 mg / cm 2. </li><li> Incubar pratos, pelo menos durante 1 hora à temperatura ambiente e lava-se duas vezes com água destilada (A. tridest). </li><li> Permitir que os pratos para secar adequadamente. </li></ol></li><li> A suplementação do mei...

<ol>
	<li>Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+mouse+cortical+collecting+duct+cell+line.">Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line.</a> Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).</li><li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. 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Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).</li><li>Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-2+expression+in+primary+cultured+rat+inner+medullary+collecting+duct+cells.">Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells.</a> Am. J. 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Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).</li><li>Maric, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+volume+kinetics+of+adherent+epithelial+cells+measured+by+laser+scanning+reflection+microscopy:+determination+of+water+permeability+changes+of+renal+principal+cells.">Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells.</a> Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).</li><li>Gonzalez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+stimulates+renin+in+inner+medullary+collecting+duct+cells+via+protein+kinase+C+and+independent+of+epithelial+sodium+channel+and+mineralocorticoid+receptor+activity.">Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity.</a> Hypertension. 57, 594-599 (2011).</li><li>Chou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+aquaporin-2+trafficking+by+vasopressin+in+the+renal+collecting+duct.+Roles+of+ryanodine-sensitive+Ca2++stores+and+calmodulin.">Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).</li><li>Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+native+inner+medullary+collecting+duct+cells+from+rat+kidney.">Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney.</a> Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).</li><li>Tchapyjnikov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+nuclei+from+native+renal+inner+medullary+collecting+duct+cells+using+LC-MS/MS.">Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS.</a> Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).</li><li>Stefan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+cAMP-dependent+signaling+by+phosphodiesterase-4D+is+involved+in+the+regulation+of+vasopressin-mediated+water+reabsorption+in+renal+principal+cells.">Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).</li><li>Klussmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inhibitory+role+of+Rho+in+the+vasopressin-mediated+translocation+of+aquaporin-2+into+cell+membranes+of+renal+principal+cells.">An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells.</a> J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).</li></ol>

Nós apresentamos um protocolo detalhado para a preparação e cultivo de células IMCD primárias de rato. A abordagem rende até 21 cm 2 de células de um rato 20. O ensaio requer um equipamento padrão de cultura de células e pode ser realizada por uma única pessoa dentro de aproximadamente 6 horas. Por conseguinte, esta abordagem é adequada como um método padrão de laboratório. IMCD células primárias de rato podem ser semeadas em placas de cultura de diferen...

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Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Na recolha de células renais de condutas principais, a arginina-vasopressina (AVP) controla a reabsorção de água, estimulando a inserção do canal de água aquaporina-2 (AQP2) na membrana plasmática. AVP se liga à proteína acoplada vasopressina tipo-2, receptor de G (V2R) estimular a adenilil ciclase e assim a formação de AMPc. Iniciação desta cascata de sinalização conduz à activação da proteína quinase A (PKA). PKA fosforila AQP2 na serina 256 (S256), que é o factor chave para a sua redistribuição intracelular de vesículas na membrana plasmática. A inserção da membrana facilita a reabsorção de água ao longo de um gradiente osmótico e afina corpo homeostase da água. Desregulação da reabsorção de água AVP-mediada, devido a aberrações da secreção de AVP ou causas sinalização AVP ativados ou está associada a doenças graves. Diminuição da reabsorção de água causada por mutações de V2R ou AQP2 leva a diabetes insípido nefrogênico, enquanto um elevnível AVP plasma sanguíneo decido está associada a reabsorção excessiva de água em doenças cardiovasculares, como insuficiência cardíaca crônica ea síndrome da secreção do hormônio antidiurético inapropriado (SIADH). O significado da reabsorção de água mediada por AVP resulta não só a partir da sua implicação na doença. A translocação AVP induzida por vesículas AQP2-rolamento e fusão com a membrana plasmática representa um processo exocitica estritamente cAMP-dependente, o que atualmente não é bem compreendida. Outros exemplos de um exocitose dependente de AMPc são a secreção de renina a nível renal, secreção de H + no estômago. Portanto, a elucidação dos mecanismos moleculares que regulam a AQP2-translocação em células renais principais não só ajuda a compreender os processos moleculares semelhantes em outros tipos de células, mas também pode abrir o caminho para novas terapias para o tratamento de doenças associadas a distúrbios da reabsorção de água mediada por AVP . Elucidating AQP2 mecanismos de controle requer a coleta principais modelos de células do duto. Por isso, uma série de diferentes linhas de células de rim de mamífero estão disponíveis. No entanto, estes modelos têm vários inconvenientes. Em muitos sistemas de célula o nível de proteína AQP2 é baixa (Tabela 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, outros ectopicamente superexpressam humanos (MCD4, WT10) ou 11,12 rato (CD8) 13 AQP2. Em MCD4 e células COS-7 do receptor V2 não é expresso. Para o nosso conhecimento, não há linha de células permanente como um modelo disponível, que é derivada da recolha da medula renal conduta interior, a parte do rim onde AQP2 expressão é mais abundante, mas a partir da conduta de recolha cortical 1,11,13-16 . Tais modelos de células são por exemplo os mpkCCD imortalizada utilizada (por exemplo, 17) ou os mTERT CCD 14 linhas de células recentemente estabelecidas. Ambas as linhas de células endogenamente AQP2 expressa e V2R, mas uma vez que eles são derivados daduto coletor cortical provavelmente conter um proteoma diferente em relação ao coletor medular interno células do duto (IMCD). Eles devem, por exemplo, expressar diferente Na + sistemas de transporte. Aqui, apresentamos um protocolo de cultura de células primárias IMCD expressando V2R e AQP2 endogenamente. Este modelo, portanto, representa mais de perto a situação fisiológica no ducto coletor renal. Como estabelecer a cultura exige apenas padrão de laboratório, equipamento de outros laboratórios podem facilmente adotar essa abordagem.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company Catalog</td>
			<td>Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type IV Mouse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356233</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H6254</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type CLS-II</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>C2-22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutMAX</td>
			<td>Invitrogen GIBCO</td>
			<td>21885108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>N4014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultroser G</td>
			<td>Cytogen</td>
			<td>15950-017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential amino acids (NEA)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>K0293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Invitrogen GIBCO</td>
			<td>15710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBcAMP</td>
			<td>BIOLOG</td>
			<td>D009</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing primary rat inner medullary collecting duct cells

Arginina-vasopressina (AVP), facilita a reabsorção de água por renal coletando células principais do duto e, assim, afina corpo homeostase da água. AVP se liga aos receptores de vasopressina V2 (V2R) na superfície das células e, assim, induz a síntese de cAMP. Este estimula a processos de sinalização intracelular que conduzem a alterações na fosforilação do canal de água aquaporina-2 (AQP2). Proteína cinase A phoshorylates AQP2 gerando assim a translocação de AQP2 de vesículas intracelulares para a membrana plasmática facilitar a reabsorção de água a partir da urina primária. Aberrações de libertação da AVP sinalização pituitária ou AVP-activado em células principais podem causar insipidus nefrogénica centrais ou diabetes, respectivamente, um nível elevado de AVP plasma sanguíneo está associada com doenças cardiovasculares, tais como insuficiência cardíaca crónica e síndroma de secreção inapropriada de hormona antidiurética. Aqui, apresentamos um protocolo para cultivatino de rato principal coletor medular interno células do duto (IMCD), que expressa V2R e AQP2 endogenamente. As células são adequados para a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes ao controlo das AQP2 e, portanto, para descobrir novos alvos terapêuticos para o tratamento de doenças associadas com a desregulação da reabsorção de água mediada por AVP. IMCD células são obtidas a partir de ratos medulas interior renal e são utilizados em experiências de seis a oito dias após a semeadura. IMCD células podem ser cultivadas em placas de cultura de células normais, frascos e placas de micro-titulação de formatos diferentes, o procedimento requer apenas algumas horas, e é apropriado para laboratórios de cultura de células padrão.

O sucesso do cultivo de células primárias de rato IMCD resultará numa monocamada confluente de 6-8 dias após a sementeira (Figura 2). Por 60 milímetros prato de cultura há aproximadamente 6 x 10 6 células. As células firmemente aderir às placas de cultura, uma vez que estes foram revestidos com colagénio do tipo IV, um componente da membrana basal 18. Portanto, as células IMCD não irá separar mesmo durante vários procedimentos de lavagem cuidadosa. Até 80% das célul...

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Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Arginina-vasopressina (AVP) controla o ajuste fino da homeostase de água do corpo, facilitando a reabsorção de água pelas células principais renais. Aqui, apresentamos um protocolo para o cultivo de rato principal coletor medular interno células do duto adequados para a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes à reabsorção de água AVP-mediada.

Cultura primária Rat coletor medular interno células dos ductos

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

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