Name: a multiplexed luciferase-based screening platform for interrogating cancer-associated signal transduction in cultured cells
Uploaded: 2013-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells at JoVE.com

ونحن نعترف الدعم المالي من CPRIT (RP100119) ومؤسسة وولش (I-1665).

بروتوكول كامل يستغرق حوالي 4 أيام. 1. إعداد الخلايا لسيرنا ومراسل ترنسفكأيشن وسوف أعرض هنا بروتوكولا لاستجواب المكتبات سيرنا باستخدام مجموعة صغيرة من الرناوات siRNAs (384 مختلفة سيرنا برك مجموعة ف?...

<ol>
	<li>Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemiluminescent+and+bioluminescent+reporter+gene+assays.">Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays.</a> Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).</li><li>Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+luminescent+reporter+gene+assays.">Seeing the light: luminescent reporter gene assays.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).</li><li>McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+systems+in+Drosophila:+a+synthesis+of+time+and+space.">Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space.</a> Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).</li><li>Smirnova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Neh2-luciferase+reporter+and+its+application+for+high+throughput+screening+and+real-time+monitoring+of+Nrf2+activators.">Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators.</a> Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+disruption+of+Wnt-dependent+signaling+in+tissue+regeneration+and+cancer.">Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer.</a> Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).</li><li>Tang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+for+Wnt/beta-catenin+pathway+components+identifies+unexpected+roles+for+TCF+transcription+factors+in+cancer.">A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).</li><li>Lum, L. D., Kulak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Luciferase+Reporter+Assay+Systems.">Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems.</a> United States patent. , (2012).</li><li>Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptionally+active+DNA-binding+site+for+human+p53+protein+complexes.">A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes.</a> Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).</li><li>DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+the+Wnt-wingless+signaling+pathway.">Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway.</a> Science. 308, 826-833 (2005).</li><li>Korinek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+epithelial+stem-cell+compartments+in+the+small+intestine+of+mice+lacking+Tcf-4.">Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4.</a> Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).</li><li>Korinek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+members+of+the+Tcf+family+implicated+in+Wnt/beta-catenin+signaling+during+embryogenesis+in+the+mouse.">Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse.</a> Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+characterization+of+human+colon+and+rectal+cancer.">Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer.</a> Nature. 487, 330-337 (2012).</li><li>Koboldt, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. , (2012).</li><li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+landscapes+of+human+breast+and+colorectal+cancers.">The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+genome-wide+RNA+interference+screens.">Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens.</a> Science Signaling. 2, pt4 (2009).</li><li>Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+to+dissect+cellular+pathways:+a+how-to+guide.">High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide.</a> Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).</li><li>Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell-based+RNAi+screens.">Analysis of cell-based RNAi screens.</a> Genome Biology. 7, R66 (2006).</li><li>Gilbert, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multiplex+cell+viability+assay+for+high-throughput+RNAi+screening.">A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening.</a> PLoS ONE. 6, e28338 (2011).</li></ol>

وهناك العديد من مروجي أنظمة المستندة إلى مراسل luciferase المراسل (مثل PROMEGA، نظم الاستهداف، نيو انغلاند Biolabs، والحرارية فيشر) التي توفر الموارد على الخط مفيدة لأولئك مسلية شاشة عالية الإنتاجية للمرة الأولى. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن عددا من الاستعراضات ممتازة بشأن تحقيق ?...

مجموعة متنوعة من الصحفيين على وسيفيراز لرصد مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية خلية متاحة تجاريا. غالبية هذه البروتينات الحمض النووي يبني ترميز وسيفيراز التي يسببها وصريح من قبل المحفزات خلية معينة أو اضطرابات. الأكثر صحفيين قوية مقرها transcriptionally وضع التعبير عن انزيم luciferase المراسل تحت سيطرة عناصر محسن الاصطناعية أو مناطق المروج الجين راسخة لموثوقيتها في الإبلاغ عن ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية النسخي 1،2 حدث. وهناك أيضا نظم عبر مراسل luciferase التي تستخدم GAL4-UAS لدفع وسيفيراز تعبير البروتين. GAL4 هي الخميرة النسخي المنشط وUAS هو محسن الذي يربط GAL4 خصيصا لتفعيل النسخ من تسلسل الجينات وضعت أسفل تيار من ذلك 3. وعادة ما يتم اعتماد هذه الأنواع من أنظمة وسيفيراز من قبل اثنين من البلازميدات الحمض النووي - واحد بترميز البروتين GAL4 تنصهر إلى regulatoراي جزء من البروتين من الفائدة، والثاني يشفر بروتين وسيفيراز وضعت تحت سيطرة واحدة أو أكثر UAS متواليات. وهكذا، فإن إشارة وسيفيراز الخلوية يعكس مستوى النشاط من البروتين من الفائدة. آخر الاستخدام المشترك للصحفيين المستندة إلى وسيفيراز هو لرصد استقرار البروتين حيث يتم تنصهر بروتين من الفائدة إلى إنزيم وسيفيراز 4. بغض النظر عن نوع من المراسل، ويلاحظ على مسؤولية المشتري هنا كما لا يستطيع المرء تحمل خصوصية أي مراسل لتم استجوابه بشكل جيد. وبالتالي، مطلوب العناية الواجبة في إدماج بنيات مراسل جديدة في أي استراتيجية للبحوث. اختيار الانزيم وسيفيراز قراءة خارج يمكن أن تكون مهمة مثل الاعتماد على عناصر DNA التي تتحكم في التعبير عنها. في حين luciferase يراعة (FL) هو انزيم الأكثر استخداما في التركيبات المتاحة تجاريا، وظهور أنظمة مراسل luciferase الجديدة التي لا تتطلب ATP (كما في حالةمن ردود الفعل على أساس FL) أو التي تتضمن الإنزيمات أكثر استقرارا التي تنبعث منها إشارات أقوى نعد لتحسين كفاءة وموثوقية منصة الأبحاث هذه. ملاحظة هامة فيما يتعلق باختيار صحفيين وسيفيراز في الدراسات الكيميائية هو قابلية FL على تثبيط المواد الكيميائية التي يمكن أن تؤدي إلى تقارير كاذبة. في تجربتنا، والإنزيمات الأخرى مثل Renilla أو Gaussia وسيفيراز (RL وGL، على التوالي) التي تستخدم coelenterazine باعتبارها الركيزة هي تثبيط أقل بسهولة بواسطة الجزيئات الصغيرة 5. الشكل الأكثر شيوعا لتعدد وسيفيراز قراءة عموميات تنطوي على استخدام FL وRL نظرا إلى حد كبير بتوافر سهلة الاستخدام لمجموعات مع القدرة على قياس بالتسلسل الأنشطة الأنزيمية من عينة واحدة. في معظم مجموعات، ويتعرض العينات الأولى للوسيفيرين للكشف عن مستويات النشاط FL تليها كاشف التبريد التي يتم إيداعها في وقت واحد مع coelenterazine أن تسفر عن الشركة السعوديةدارى RL إشارة. مع إضافة luciferases الأخرى التي يمكن أن يفرز مثل GL أو التي تستخدم حتى الآن الركيزة أخرى مثل Cypridina وسيفيراز (CL)، وهو عدد أكبر من إمكانيات لتوليد ظهرت محتوى البيانات عالية باستخدام luciferases. مثال على شاشة رني الجينوم على نطاق باستخدام هذه التقنية يمكن العثور عليها هنا 6. هذه التقدم التكنولوجي قد بدوره حفز تطوير آليات محددة لإرواء كل نوع من انزيم luciferase المراسل من أجل الحد عبر الحديث 7. في أيدينا، ونحن نلاحظ تردد أكبر من &quot;آثار الحافة&quot; (الاتجاهات لا يمكن تفسيره في النشاط الخلوي المرتبطة حافة عالية لوحات ثقافة عيار)، مع luciferases يفرز مثل GL أو CL. من ناحية أخرى، مثل luciferases يفرز هي مفيدة لفحوصات الحركية كما أنها تمكن أخذ العينات إشارة دون غش بقاء الخلية. لدراستنا المعروضة هنا، وسوف نقوم في نفس الوقت مراقبة النشاط من ثلاثة السرطان ذات الصلةالعمليات الخلوية: وP53، KRAS، وWNT مسارات نقل الإشارة. للصحفيين أدرجت في دراستنا هي FL مراسل pp53-TA-لوك من Clontech (المشار إليه فيما مراسل P53-FL) 8، نظام مراسل Elk1-GAL4/UAS-CL (من الآن فصاعدا إلك-1 المراسل؛ اجيلنت)، وTCF مراسل RL 8X الذي يشتمل على عدة عناصر محسن الاصطناعية معترف بها من قبل WNT مسار المنظمين النسخي المعروف باسم العوامل تي خلية (أو TCFs) 9-11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PathDetect Elk1 Trans-Reporting System</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>219005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector</td>
			<td>Clontech Lab Inc.</td>
			<td>631914</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>301427</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega Corp.</td>
			<td>E1960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cypridina Luciferase Assay reagent</td>
			<td>Targeting Systems</td>
			<td>VLAR-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT116 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega Corp.</td>
			<td>G9260</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiFlo Microplate Dispenser</td>
			<td>Labsystems Inc.</td>
			<td>Model 832</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek FXP Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter Inc.</td>
			<td>A31842</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech Inc.</td>
			<td>0471-101A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Reichert Hemacytometers</td>
			<td>Hausser Scientific Company</td>
			<td>1490</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multiplexed luciferase-based screening platform for interrogating cancer-associated signal transduction in cultured cells

الاستجواب على نطاق الجينوم وظيفة الجين باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي (رني) يحمل وعدا هائلا لتحديد السريع للين العريكة كيميائيا نقاط الضعف الخلايا السرطانية. مما يحد من إمكانيات هذه التكنولوجيا هو عدم القدرة على ترسيم بسرعة أساس الآلية من نتائج المظهري وبالتالي يسترشد بها في وضع استراتيجيات علاجية تستهدف جزيئيا. نحن هنا الخطوط العريضة الأساليب لتفكيك الظواهر الخلوية الناجمة عن الجين رني بوساطة استهداف باستخدام أنظمة مراسل المضاعفة التي تسمح رصد سرطان مفتاح عمليات الخلية المرتبطة. هذه المنهجية الفرز نسبة عالية هي متعددة ويمكن تكييفه بسهولة لفحص أنواع أخرى من مكتبات الجزيئية كبيرة.

على الرغم من التقدم في رسم المشهد طفرية من السرطانات المختلفة باستخدام ضخمة جهود تسلسل الجينوم 12-14، ونحن ما زلنا لا نملك في مكان مقاربة منهجية لترجمة هذه الملاحظات إلى استراتيجيات التدخل. في سرطان القولون والمستقيم (CRC)، والطفرات التي من المتوقع أن تؤثر على مكو?...

Watch this Scientific Journal Video about A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells at JoVE.com

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

التوصل إلى فهم مستوى النظم من العمليات الخلوية هو هدف بيولوجيا الخلية في العصر الحديث. نحن هنا وصف استراتيجيات للصحفيين وسيفيراز المتنوعة من مختلف وظيفة الخلوية نقطة نهاية لاستجواب وظائف الجينات باستخدام الجينوم على نطاق والمكتبات رني.

A تعدد في منصة الفرز القائم على luciferase المراسل لاستجواب المرتبطة بالسرطان نقل الإشارة في الخلايا المستزرعة

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Research

JoVE Journal

Medicine

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

كيفية قياس الطي القشرية من صور MR : برنامج تعليمي خطوة بخطوة لحساب الرقم القياسي المحلي Gyrification

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

فحص محتوى عالية في أمراض الاعصاب

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

استعمال قياس المثانة في القوارض الصغيرة: دراسة في Chemosensation المثانة

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

الكشف عن سرطان الجلد باستخدام المعدلات اسماك الزرد الموديل ورم الأصليين

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Voluntary Breath-hold Technique for Reducing Heart Dose in Left Breast Radiotherapy

الطوعية التنفس الانتظار وتقنيات للحد من القلب جرعة العلاج الإشعاعي في اليسار الثدي

Breath-holding techniques reduce the amount of radiation received by cardiac structures during tangential-field left breast radiotherapy. With these ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

الحقن الشريان السباتي لوأضافا الدوائية وتحليل Taxanes في الفئران

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

A High-content In Vitro Pancreatic Islet ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Replication Discovery Platform

والمحتوى العالي<em&gt; في المختبر</em&gt; البنكرياس جزيرة β خلايا النسخ المتماثل منصة ديسكفري

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

فحص الجزيئات النانوية النشطة بيولوجيا في الخلايا المناعية البلعمة لمثبطات مستقبلات تشبه تول

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

روتين فحص الطريقة المجهرية الدقيقة في عمليات نقل الدم الصفيحات

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...