Name: a multiplexed luciferase-based screening platform for interrogating cancer-associated signal transduction in cultured cells
Uploaded: 2013-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells at JoVE.com

Wij erkennen de steun financieren uit CPRIT (RP100119) en de Welch Foundation (I-1665).

Gehele protocol duurt ongeveer 4 dagen. 1. Bereiding van Cellen voor siRNA transfectie en Reporter We zullen hier de invoering van een protocol voor het ondervragen van siRNA bibliotheken met behulp van een kleine set van siRNA&#39;s (384 verschillende siRNA zwembaden array in 96 well formaat met elk zwembad bestaande uit 4x siRNA gericht op een enkel gen) van een genoom-brede siRNA bibliotheek voor illustratieve doeleinden. Voor deze specifieke studie, zullen we H...

<ol>
	<li>Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemiluminescent+and+bioluminescent+reporter+gene+assays.">Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays.</a> Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).</li><li>Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+luminescent+reporter+gene+assays.">Seeing the light: luminescent reporter gene assays.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).</li><li>McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+systems+in+Drosophila:+a+synthesis+of+time+and+space.">Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space.</a> Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).</li><li>Smirnova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Neh2-luciferase+reporter+and+its+application+for+high+throughput+screening+and+real-time+monitoring+of+Nrf2+activators.">Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators.</a> Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+disruption+of+Wnt-dependent+signaling+in+tissue+regeneration+and+cancer.">Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer.</a> Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).</li><li>Tang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+for+Wnt/beta-catenin+pathway+components+identifies+unexpected+roles+for+TCF+transcription+factors+in+cancer.">A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).</li><li>Lum, L. D., Kulak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Luciferase+Reporter+Assay+Systems.">Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems.</a> United States patent. , (2012).</li><li>Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptionally+active+DNA-binding+site+for+human+p53+protein+complexes.">A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes.</a> Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).</li><li>DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+the+Wnt-wingless+signaling+pathway.">Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway.</a> Science. 308, 826-833 (2005).</li><li>Korinek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+epithelial+stem-cell+compartments+in+the+small+intestine+of+mice+lacking+Tcf-4.">Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4.</a> Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).</li><li>Korinek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+members+of+the+Tcf+family+implicated+in+Wnt/beta-catenin+signaling+during+embryogenesis+in+the+mouse.">Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse.</a> Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+characterization+of+human+colon+and+rectal+cancer.">Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer.</a> Nature. 487, 330-337 (2012).</li><li>Koboldt, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. , (2012).</li><li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+landscapes+of+human+breast+and+colorectal+cancers.">The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+genome-wide+RNA+interference+screens.">Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens.</a> Science Signaling. 2, pt4 (2009).</li><li>Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+to+dissect+cellular+pathways:+a+how-to+guide.">High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide.</a> Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).</li><li>Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell-based+RNAi+screens.">Analysis of cell-based RNAi screens.</a> Genome Biology. 7, R66 (2006).</li><li>Gilbert, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multiplex+cell+viability+assay+for+high-throughput+RNAi+screening.">A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening.</a> PLoS ONE. 6, e28338 (2011).</li></ol>

Er zijn verschillende leveranciers van luciferase-gebaseerde reporter systemen (zoals Promega, Targeting Systems, New England Biolabs, en Thermo Fisher) die nuttige middelen on-line bieden voor degenen onderhoudend een high-throughput-scherm voor de eerste keer. Daarnaast moet een aantal uitstekende recensies over het optimaliseren van het gebruik van high-throughput-schermen voor ontdekking van genen en hoe RNAi-gebaseerde screening resultaten kan worden geïntegreerd met andere-omics-methoden verkregen gegevens zijn n...

Een verscheidenheid van luciferase-gebaseerde reporters voor het bewaken van een uiteenlopende reeks van celbiologische processen zijn in de handel verkrijgbaar. De meerderheid van deze DNA-constructen coderen voor luciferase eiwitten die worden geïnduceerd om te drukken door specifieke cel stimuli of verstoringen. De robuuste transcriptie gebaseerde reporters plaats de expressie van een luciferase-enzym onder de controle van synthetische enhancer elementen of gen promoter regio gevestigde om hun betrouwbaarheid bij het ​​rapporteren een fysiologisch relevante transcriptionele event 1,2. Er zijn ook trans-reporter luciferase systemen die GAL4-UAS gebruiken om luciferase-eiwit expressie rijden. Gal4 is een gist transcriptionele activator en het UAS is een versterker waaraan Gal4 specifiek bindt aan de transcriptie van gensequenties geplaatst stroomafwaarts van het activeren 3. Deze types van luciferase systemen worden typisch door twee DNA plasmiden - een codeert voor het GAL4-eiwit gefuseerd aan de regulatory gedeelte van een eiwit van belang codeert en de tweede een luciferase-eiwit onder de controle van een of meer UAS sequenties geplaatst. Dus de cellulaire luciferase signaal geeft het activiteitsniveau van het eiwit van belang. Een ander algemeen gebruik van luciferase-gebaseerde reporters bewaakt u eiwitstabiliteit waarbij een eiwit van belang gefuseerd aan een luciferase-enzym 4. Ongeacht het type van de reporter wordt een waarschuwing emptor hier genoemd als een van de specificiteit van elk reporter goed te zijn ondervraagd kan dragen. Zo is zorgvuldigheid vereist in de integratie van nieuwe reporter constructen in een onderzoeksstrategie. De keuze van het luciferase-enzym uitlezing kan net zo belangrijk als de betrouwbaarheid van de DNA elementen die de expressie controleren. Dat vuurvlieg luciferase (FL) is de meest gebruikte enzym in de handel verkrijgbare constructen, de komst van nieuwe luciferase reporter systemen niet behoeft ATP (zoals bijvan FL-based reacties) of die betrekking hebben op meer stabiele enzymen die sterkere signalen uitzenden beloven om de efficiëntie en betrouwbaarheid van dit onderzoek platform te verbeteren. Een belangrijke opmerking met betrekking tot de selectie van luciferase reporters in chemische studies is de gevoeligheid van FL om chemische remming die aanleiding zouden kunnen geven tot valse rapporten. In onze ervaring, andere enzymen zoals Renilla of Gaussia luciferase (RL en GL, respectievelijk) dat coelenterazine gebruiken als een substraat minder gemakkelijk geremd door kleine moleculen 5. De meest voorkomende formaat voor multiplexing luciferase lees-outs houdt het gebruik van FL en RL grotendeels gezien de beschikbaarheid van eenvoudig te gebruiken kits met de mogelijkheid om sequentieel te meten enzymatische activiteiten van een enkel monster. In de meeste kits worden monsters eerst blootgesteld aan luciferine niveaus van FL activiteit gevolgd door quenching reagens dat gelijktijdig afgezet met coelenterazine een secon leveren onthullendaire RL signaal. Met de toevoeging van andere luciferasen die kunnen worden uitgescheiden, zoals GL of dit gebruik nog een ander substraat zoals Cypridina luciferase (CL), een groter aantal mogelijkheden voor het genereren van een grote hoeveelheid gegevens met luciferasen ontstaan. Een voorbeeld van een genoom-brede RNAi scherm met behulp van deze techniek kan hier 6 te vinden. Deze technologische ontwikkelingen hebben op hun beurt geleid tot de ontwikkeling van specifieke mechanismen om elk type luciferase enzym lessen om overspraak 7 te beperken. In onze handen, merken we een grotere frequentie van &quot;edge effecten&quot; (onverklaarbare trends in de cellulaire activiteit in verband met de rand van een hoge titer cultuur platen), met afgescheiden luciferases zoals GL of CL. Anderzijds, zoals afgescheiden luciferasen bruikbaar voor kinetische analyses zoals zij stellen signaalbemonstering zonder knoeien cellevensvatbaarheid. Voor ons hier gepresenteerde onderzoek, zullen we tegelijkertijd de activiteit van de drie kanker-relevantcellulaire processen: de p53, Kras, en Wnt signaaltransductie. De reporters opgenomen in onze studie is de pp53-TA-Luc reporter FL van Clontech (hierna aangeduid als p53-FL reporter) 8, een Elk1-GAL4/UAS-CL reportersysteem (voortaan Elk-1 reporter, Agilent), en de 8X TCF RL verslaggever die meerdere synthetische enhancerelementen erkend door de Wnt-pathway transcriptieregulatoren bekend als T-cel-factoren (of TCF) 9-11 bevat.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PathDetect Elk1 Trans-Reporting System</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>219005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector</td>
			<td>Clontech Lab Inc.</td>
			<td>631914</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>301427</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega Corp.</td>
			<td>E1960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cypridina Luciferase Assay reagent</td>
			<td>Targeting Systems</td>
			<td>VLAR-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT116 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega Corp.</td>
			<td>G9260</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiFlo Microplate Dispenser</td>
			<td>Labsystems Inc.</td>
			<td>Model 832</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek FXP Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter Inc.</td>
			<td>A31842</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech Inc.</td>
			<td>0471-101A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Reichert Hemacytometers</td>
			<td>Hausser Scientific Company</td>
			<td>1490</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multiplexed luciferase-based screening platform for interrogating cancer-associated signal transduction in cultured cells

Genoom-schaal ondervraging van gen-functie met behulp van RNA interferentie (RNAi) betekent een enorme belofte voor de snelle identificatie van chemisch handelbaar kankercel kwetsbaarheden. De kans dat deze technologie is het onvermogen om snel bakenen de mechanistische basis van fenotypische resultaten en dus stelt de ontwikkeling van moleculair gerichte therapie. We schetsen hier methoden om cellulaire fenotypes geïnduceerd door RNAi-gemedieerde gen-targeting met behulp van multiplex-reporter systemen die de controle op belangrijke kankercel-geassocieerde processen kunnen deconstrueren. Deze high content methode is veelzijdig en kan gemakkelijk worden aangepast voor de screening van andere typen grote moleculaire bibliotheken.

Ondanks de vooruitgang in kaart brengen van de mutatie-landschap van verschillende vormen van kanker met behulp van enorme genoom sequencing inspanningen 12-14, we nog steeds niet beschikken over een systematische aanpak voor het vertalen van deze observaties in interventiestrategieën. In colorectale kanker (CRC), mutaties die voorspeld bestanddelen drie cellulaire processen beïnvloeden - Wnt / β-catenine, p53, Kras en signalering - worden gevonden in 99% van alle tumoren suggereren zij pijlers van cellula...

Watch this Scientific Journal Video about A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells at JoVE.com

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Research

JoVE Journal

Medicine

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Hoe kan ik Corticale Folding Meet vanaf MR Foto&#39;s: een stap-voor-stap handleiding voor lokale Gyrification Index Compute

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Hoog gehalte Screening bij neurodegeneratieve ziekten

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

Het gebruik van Cystometry in kleine knaagdieren: Een studie van de blaas Chemosensation

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Screening op Melanoom Modifiers het gebruik van een zebravis Autochtone tumormodel

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Voluntary Breath-hold Technique for Reducing Heart Dose in Left Breast Radiotherapy

Vrijwillige Breath-hold techniek ter vermindering Hart Dosis in linkerborst Radiotherapie

Breath-holding techniques reduce the amount of radiation received by cardiac structures during tangential-field left breast radiotherapy. With these ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Halsslagader Infusions voor farmacokinetische en farmacodynamische analyse van Taxanen in Muizen

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studeren alvleesklier- Stamcel Kenmerken voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

A High-content In Vitro Pancreatic Islet ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Replication Discovery Platform

Een High-gehalte<em&gt; In Vitro</em&gt; Eilandjes van Langerhans β-cel Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

Screening van bioactieve nanodeeltjes in phagocytische immuuncellen voor inhibitors van Toll-achtige Receptor Signalering

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Routine Screening Method voor microdeeltjes in bloedplaatjes transfusies

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...