Name: a multiplexed luciferase-based screening platform for interrogating cancer-associated signal transduction in cultured cells
Uploaded: 2013-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells at JoVE.com

Wir erkennen an, finanzielle Unterstützung von CPRIT (RP100119) und der Welch Foundation (I-1665).

Entire Protokoll dauert ca. 4 Tage. 1. Vorbereitung der Zellen für siRNA Transfektion und Reporter Wir werden hier vorstellen ein Protokoll für die Abfrage von siRNA-Bibliotheken mit einem kleinen Satz von siRNAs (384 verschiedene siRNA-Pools Array in 96-Well-Format mit jedem Pool, bestehend aus 4x siRNAs ein einzelnes Gen) aus einer genomweiten siRNA-Bibliothek zu illustrativen Zwecken. Für diese besondere Studie werden wir nutzen HCT116 Zellen, die abweichende...

<ol>
	<li>Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemiluminescent+and+bioluminescent+reporter+gene+assays.">Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays.</a> Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).</li><li>Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+luminescent+reporter+gene+assays.">Seeing the light: luminescent reporter gene assays.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).</li><li>McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+systems+in+Drosophila:+a+synthesis+of+time+and+space.">Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space.</a> Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).</li><li>Smirnova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Neh2-luciferase+reporter+and+its+application+for+high+throughput+screening+and+real-time+monitoring+of+Nrf2+activators.">Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators.</a> Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+disruption+of+Wnt-dependent+signaling+in+tissue+regeneration+and+cancer.">Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer.</a> Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).</li><li>Tang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+for+Wnt/beta-catenin+pathway+components+identifies+unexpected+roles+for+TCF+transcription+factors+in+cancer.">A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).</li><li>Lum, L. D., Kulak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Luciferase+Reporter+Assay+Systems.">Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems.</a> United States patent. , (2012).</li><li>Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptionally+active+DNA-binding+site+for+human+p53+protein+complexes.">A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes.</a> Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).</li><li>DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+the+Wnt-wingless+signaling+pathway.">Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway.</a> Science. 308, 826-833 (2005).</li><li>Korinek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+epithelial+stem-cell+compartments+in+the+small+intestine+of+mice+lacking+Tcf-4.">Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4.</a> Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).</li><li>Korinek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+members+of+the+Tcf+family+implicated+in+Wnt/beta-catenin+signaling+during+embryogenesis+in+the+mouse.">Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse.</a> Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+characterization+of+human+colon+and+rectal+cancer.">Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer.</a> Nature. 487, 330-337 (2012).</li><li>Koboldt, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. , (2012).</li><li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+landscapes+of+human+breast+and+colorectal+cancers.">The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+genome-wide+RNA+interference+screens.">Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens.</a> Science Signaling. 2, pt4 (2009).</li><li>Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+to+dissect+cellular+pathways:+a+how-to+guide.">High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide.</a> Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).</li><li>Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell-based+RNAi+screens.">Analysis of cell-based RNAi screens.</a> Genome Biology. 7, R66 (2006).</li><li>Gilbert, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multiplex+cell+viability+assay+for+high-throughput+RNAi+screening.">A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening.</a> PLoS ONE. 6, e28338 (2011).</li></ol>

Es gibt mehrere Lieferanten von Luciferase Reporter-basierte Systeme (wie Promega, Zielsysteme, New England Biolabs, und Thermo Fisher), die nützliche Online-Ressourcen zur Verfügung für diejenigen unterhaltsam ein Hochdurchsatz-Screening für die erste Zeit. Darüber hinaus sollte eine Reihe von ausgezeichneten Bewertungen in Bezug auf die Optimierung der Nutzung von High-Throughput-Screens für die Gen-Entdeckung und wie RNAi-basierte Screening-Ergebnisse mit anderen-omics-basierten Datensätzen integriert werden h...

Eine Vielzahl von Luciferase-basierte Reporter zur Überwachung einer Vielfalt von zellbiologischen Prozesse sind im Handel erhältlich. Die Mehrzahl dieser DNA-Konstrukte kodieren Proteine, die Luciferase induziert durch spezifische Reize Zelle oder Störungen auszudrücken. Die robuste transkriptionell basierte Reportern platzieren die Expression eines Enzyms Luciferase unter der Kontrolle von synthetischen Enhancer-Elemente oder Gen-Promotor-Regionen für ihre Zuverlässigkeit in der Berichterstattung eine physiologisch relevante Transkriptions-Veranstaltung 1,2 etabliert. Es gibt auch trans-Reporter Luciferase-Systeme, die GAL4-UAS zu nutzen, um Luciferase Proteinexpression fahren. Gal4 ist ein Hefe-Transkriptions-Aktivator und die UAS ist ein Enhancer, die Gal4 spezifisch bindet, um die Transkription der Gensequenzen angeordnet stromabwärts davon 3 zu aktivieren. Diese Arten von Luciferase-Systeme sind in der Regel von zwei DNA-Plasmide getragen - ein GAL4-Protein kodiert, das fusioniert an die regulatorischery Teil eines Proteins von Interesse, und die zweite Luciferase kodiert für ein Protein unter der Kontrolle eines oder mehrerer UAS-Sequenzen angeordnet. Somit spiegelt die zelluläre Luciferasesignal die Aktivität des Proteins von Interesse. Eine andere übliche Anwendung von Luciferase-basierte Reporter dient zur Überwachung Proteinstabilität, wodurch ein Protein von Interesse an einer Luciferaseenzyms 4 fusioniert ist. Unabhängig von der Art der Reporter wird ein Gewährleistungsausschluss hier kann man nicht davon ausgehen, die Spezifität von jedem Reporter zu gut verhört haben zur Kenntnis genommen. Somit wird Due Diligence in den Einbau von neuen Reporter-Konstrukte in jeder Forschung Strategie erforderlich. Die Auswahl des Luciferaseenzyms Auslesen kann ebenso wichtig sein wie die Zuverlässigkeit der DNA-Elemente, die ihren Ausdruck kontrollieren. Während Glühwürmchen-Luciferase (FL) ist das am häufigsten verwendete Enzym in im Handel erhältlichen Konstrukte wird das Aufkommen der neuen Luciferase-Reporter-Systeme, die keine ATP (wie im Fallvon FL-basierte Reaktionen) oder dass integrieren stabiler Enzyme, die stärkere Signale aussenden versprechen, um die Effizienz und Zuverlässigkeit dieser Forschungsplattform zu verbessern. Ein wichtiger Hinweis für die Auswahl der Luciferase Reporter in chemische Untersuchungen ist die Anfälligkeit von FL auf chemische Hemmung, die Anlass zu falschen Berichten geben könnte. Nach unserer Erfahrung sind auch andere Enzyme wie Renilla Luciferase oder Gaussia (RL und GL, respectively), die Coelenterazin verwenden als Substrat weniger leicht gehemmt durch kleine Moleküle 5. Das gängigste Format zum Multiplexen Luciferase Auslesen bringt die Verwendung von FL und RL weitgehend angesichts der Verfügbarkeit von easy-to-use-Kits mit der Fähigkeit, nacheinander messen enzymatischen Aktivitäten aus einer einzigen Probe. In den meisten Kits, werden die Proben zunächst auf Luciferin ausgesetzt Ebenen der FL Aktivität durch eine Quenchreagens gefolgt, die gleichzeitig mit Coelenteracin abgeschieden wird, um eine gebraucht ergeben offenbarendary RL Signal. Mit dem Zusatz von anderen Luciferasen, wie GL oder dass auf ein weiteres Substrat, wie Cypridina Luciferase (CL), eine größere Anzahl von Möglichkeiten zur Erzeugung von Daten mit hohen Luciferasen entstanden abgesondert werden kann. Ein Beispiel für eine genomweite RNAi-Bildschirm mit Hilfe dieser Technik können hier 6 gefunden werden. Diese technologischen Fortschritte haben wiederum trieb die Entwicklung von spezifischen Mechanismen, um jede Art von Luciferaseenzyms stillen, um cross-talk 7 begrenzen. In unseren Händen, stellen wir eine größere Häufigkeit von &quot;Randeffekte&quot; (unerklärliche Trends in Zellaktivität mit der Kante des hohen Titer Kultur Platten verbunden sind), mit abgesondert Luziferasen wie GL oder CL. Auf der anderen Seite sind solche sezerniert Luciferasen aus kinetischen Assays nützlich, da sie Signalabtastung ohne Verfälschung Zelllebensfähigkeit ermöglichen. Für unsere hier vorgestellten Studie, werden wir gleichzeitig die Aktivitäten der drei Krebs-relevantezelluläre Prozesse: die p53, Kras und Wnt Signaltransduktion. Die Reporter in unserer Studie einbezogen sind die pp53-TA-Luc FL Reporter von Clontech (im Folgenden auch als p53-FL Reporter bezeichnet) 8, eine Elk1-GAL4/UAS-CL Reporter System (im Folgenden Elk-1-Reporter, Agilent), und die 8X TCF RL Reporter, die mehrere synthetische Enhancer-Elemente von den Wnt-Signalweg Transkriptionsfaktoren wie T-Zell-Faktoren (oder TCFs) 9-11 bekannt anerkannt enthält.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PathDetect Elk1 Trans-Reporting System</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>219005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector</td>
			<td>Clontech Lab Inc.</td>
			<td>631914</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>301427</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega Corp.</td>
			<td>E1960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cypridina Luciferase Assay reagent</td>
			<td>Targeting Systems</td>
			<td>VLAR-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT116 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega Corp.</td>
			<td>G9260</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiFlo Microplate Dispenser</td>
			<td>Labsystems Inc.</td>
			<td>Model 832</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek FXP Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter Inc.</td>
			<td>A31842</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech Inc.</td>
			<td>0471-101A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Reichert Hemacytometers</td>
			<td>Hausser Scientific Company</td>
			<td>1490</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multiplexed luciferase-based screening platform for interrogating cancer-associated signal transduction in cultured cells

Genome-scale Verhör der Genfunktion mittels RNA-Interferenz (RNAi) birgt ein enormes Versprechen für die schnelle Identifizierung von chemisch gefügig Krebszelle Schwachstellen. Die Begrenzung der Potenzial dieser Technologie ist die Unfähigkeit, schnell zu beschreiben die mechanistische Grundlage der Ergebnisse und somit phänotypische informieren die Entwicklung von molekular zielgerichtete therapeutische Strategien. Wir skizzieren hier Methoden zur zellulären Phänotypen durch RNAi-vermittelte Gen-Targeting mit Multiplex-Reporter-Systeme, die Überwachung der wichtigsten Krebszelle-assoziierte Prozesse ermöglichen induziert dekonstruieren. Diese High-Content-Screening-Methode ist vielseitig und kann leicht für das Screening von anderen Arten von großen molekularen Bibliotheken angepasst werden.

Trotz der Fortschritte bei der Kartierung der Mutations-Landschaft von verschiedenen Krebsarten mit massiven Genom-Sequenzierung Bemühungen 12-14, haben wir noch nicht im Ort haben einen systematischen Ansatz für die Umsetzung dieser Beobachtungen in Interventionsstrategien. In Darmkrebs (CRC), Mutationen, die voraussichtlich drei Komponenten des zellulären Prozesse beeinflussen werden - Wnt / β-Catenin, p53 und Kras-Signalisierung - sind in 99% aller Tumoren hindeutet, sie sind wichtige Treiber der zellu...

Watch this Scientific Journal Video about A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells at JoVE.com

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Das Erreichen einer Systemebene Verständnis zellulärer Prozesse ist ein Ziel der modernen Zellbiologie. Wir beschreiben hier Strategien zum Multiplexen Luciferase Reporter von verschiedenen zellulären Funktion Endpunkte zur Genfunktion mit genomweiten RNAi-Bibliotheken zu verhören.

Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Research

JoVE Journal

Medicine

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Wie kortikale Faltung von MR-Bildern messen: eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Local Gyrification Index Compute

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Forschung

Medizin

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

Die Verwendung von Zystometrie in kleine Nagetiere: A Study of Bladder Chemosensorik

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Screening für Melanom Modifiers mit einem Zebrafisch Autochthone Tumormodell

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Voluntary Breath-hold Technique for Reducing Heart Dose in Left Breast Radiotherapy

Freiwillige Atemanhaltetechnik zur Verringerung der Herz-Dose in der linken Brust Strahlentherapie

Breath-holding techniques reduce the amount of radiation received by cardiac structures during tangential-field left breast radiotherapy. With these ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Halsschlagader Infusionen für pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Analyse von Taxanen in Mäusen

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

A High-content In Vitro Pancreatic Islet ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Replication Discovery Platform

Ein hoher Gehalt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-Zell-Replikation-Discovery-Plattform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

Screening bioaktiver Nanopartikel in phagozytischen Immunzellen für Inhibitoren der Toll-like Receptor Signaling

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Routine-Screening Methode für Mikropartikel in Thrombozytentransfusionen

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...