Name: a multiplexed luciferase-based screening platform for interrogating cancer-associated signal transduction in cultured cells
Uploaded: 2013-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells at JoVE.com

우리는 CPRIT (RP100119) 및 웰치 재단 (I-1665)의 자금 지원을 인정합니다.

전체 프로토콜은 약 사일 소요됩니다. 1. siRNA를 및 기자 형질에 대한 세포의 준비 우리는 여기에서 설명을위한 게놈 전체의 siRNA 라이브러리에서 siRNAs에의 작은 집합 (하나의 유전자를 대상으로 배 siRNAs에 구성된 각 풀에 96도 형식으로 384 가지의 siRNA 풀 배열)을 사용하여 siRNA의 라이브러리를 심문하기위한 프로토콜을 소개합니다. 이 특정 연구를 위해, ?...

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	<li>Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemiluminescent+and+bioluminescent+reporter+gene+assays.">Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays.</a> Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).</li><li>Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+luminescent+reporter+gene+assays.">Seeing the light: luminescent reporter gene assays.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).</li><li>McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+systems+in+Drosophila:+a+synthesis+of+time+and+space.">Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space.</a> Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).</li><li>Smirnova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Neh2-luciferase+reporter+and+its+application+for+high+throughput+screening+and+real-time+monitoring+of+Nrf2+activators.">Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators.</a> Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+disruption+of+Wnt-dependent+signaling+in+tissue+regeneration+and+cancer.">Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer.</a> Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).</li><li>Tang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+for+Wnt/beta-catenin+pathway+components+identifies+unexpected+roles+for+TCF+transcription+factors+in+cancer.">A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).</li><li>Lum, L. D., Kulak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Luciferase+Reporter+Assay+Systems.">Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems.</a> United States patent. , (2012).</li><li>Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptionally+active+DNA-binding+site+for+human+p53+protein+complexes.">A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes.</a> Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).</li><li>DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+the+Wnt-wingless+signaling+pathway.">Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway.</a> Science. 308, 826-833 (2005).</li><li>Korinek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+epithelial+stem-cell+compartments+in+the+small+intestine+of+mice+lacking+Tcf-4.">Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4.</a> Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).</li><li>Korinek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+members+of+the+Tcf+family+implicated+in+Wnt/beta-catenin+signaling+during+embryogenesis+in+the+mouse.">Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse.</a> Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+characterization+of+human+colon+and+rectal+cancer.">Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer.</a> Nature. 487, 330-337 (2012).</li><li>Koboldt, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. , (2012).</li><li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+landscapes+of+human+breast+and+colorectal+cancers.">The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+genome-wide+RNA+interference+screens.">Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens.</a> Science Signaling. 2, pt4 (2009).</li><li>Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+to+dissect+cellular+pathways:+a+how-to+guide.">High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide.</a> Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).</li><li>Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell-based+RNAi+screens.">Analysis of cell-based RNAi screens.</a> Genome Biology. 7, R66 (2006).</li><li>Gilbert, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multiplex+cell+viability+assay+for+high-throughput+RNAi+screening.">A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening.</a> PLoS ONE. 6, e28338 (2011).</li></ol>

처음으로 높은 처리량 화면을 접대하는 데 유용에 대한 온라인 리소스를 제공 루시퍼 기반 기자 시스템의 여러 조달업자 (예 : Promega 사 등, 대상 시스템, 뉴 잉글랜드 Biolabs가, 그리고 써모 피셔)가 있습니다. 또한, 유전자 발견 방법 및 RNAi의 기반 검사 결과는 다른 - 오 믹스 기반 데이터 셋과 통합 될 수 높은 처리량 스크린의 사용을 최적화에 대한 훌륭한 리뷰의 숫자는 도움 15,16해야합니다.<...

세포 생물 학적 과정의 다양한 배열을 모니터링 루시퍼 기반 기자의 다양한 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이러한 DNA의 대부분은 특정 세포 자극이나 교란에 의해 표현하는 유도 루시퍼 단백질을 인코딩 구성합니다. 가장 강력한 transcriptionally 기반 기자 합성 증강 요소 또는 유전자의 프로모터 영역 생리학 관련 전사 이벤트 1,2를보고 자신의 신뢰성을 잘 확립의 제어하에 루시 페라 제 효소의 발현을 배치합니다. 루시 페라 제 단백질 발현을 유도하는 GAL4-UAS를 활용 횡단 기자 루시퍼 시스템도 있습니다. GAL4는 효모 전사 활성과 UAS는 GAL4은 특별히 3의 하류에 배치 유전자 서열의 전사를 활성화하기 위해 바인딩을 증강이다. 루시퍼 시스템의 이러한 유형은 일반적으로 두 개의 DNA 플라스미드에 의해 지원됩니다 - 하나는 조절기와 융합 GAL4 단백질을 인코딩스피 관심의 단백질의 부분, 두 번째는 하나 이상의 UAS 시퀀스의 제어 아래에 배치 루시 페라 제 단백질을 인코딩합니다. 따라서, 세포 루시 페라 제 신호가 관심의 단백질의 활동 수준을 반영합니다. 루시 페라 기반 기자의 또 다른 일반적인 사용은 그 단백질 루시 페라 제 효소 4 융합 그것에 의하여 단백질의 안정성을 모니터링합니다. 하나의 잘 심문 한 어떤 기자의 특이성을지지 않습니다 수에 관계없이 기자의 종류,주의 위험 부담이 여기에 기록됩니다. 따라서, 실사가 어떤 연구 전략의 새로​​운 리포터 구조의 결합이 필요합니다. 루시 페라 제 효소 읽기 중 선택의 발현을 제어하는​​ DNA 요​​소의 신뢰성만큼 중요 할 수 있습니다. 반딧불 루시 페라 제 (FL)에 시판 구조에서 가장 일반적으로 사용되는 효소 반면, (경우와 같이 ATP를 필요로하지 않는 새로운 루시 페라 제 리포터 시스템의 출현FL-기반 반응) 또는 그이 연구 플랫폼의 효율성과 안정성을 개선 할 것을 약속 강한 신호를 방출 안정 효소를 통합합니다. 화학 연구에서 루시 페라 제 기자의 선택에 관한 중요 사항을 거짓보고에 상승을 줄 수있는 화학 물질 억제 FL의 감수성이다. 우리의 경험에서, 기판으로 coelenterazine 활용 등 Renilla의 또는 Gaussia 루시 페라 제 (각각 RL 및 GL) 등의 효소가 덜 쉽게 작은 분자 5에 의해 억제합니다. 다중 루시 페라 읽기 아웃에 대한 가장 일반적인 형식은 주로 순차적으로 하나의 샘플에서 효소 활동을 측정 할 수있는 기능을 사용하기 쉬운 키트의 가용성을 부여 FL과 RL의 사용을 수반한다. 대부분의 키트에 샘플을 먼저 동시에 secon를 산출하기 coelenterazine에 기탁되어 담금질 시약 다음 FL 활동의 수준을 나타 내기 위해 루시페린에 노출되는dary RL 신호. 이러한 GL하거나 사용하는 등 Cypridina 루시 페라 제 (CL), luciferases를 사용하여 높은 콘텐츠 데이터를 등장 생성을위한 가능성의 큰 번호와 같은 또 다른 기질로 분비 될 수있는 다른 luciferases의 추가와 함께. 이 기술을 사용하여 게놈 전체의 RNAi 화면의 예는 다음 6 찾을 수 있습니다. 이러한 기술적 진보는 차례가 크로스 토크 7을 제한하기 위해 루시 페라 제 효소의 각 유형을 냉각하는 특정 메커니즘의 개발에 박차를 가했다. 우리 손에, 우리는 GL 또는 CL 등의 분비 luciferases와 &quot;가장자리 효과&quot;(높은 역가 문화 접시의 가장자리와 관련된 세포 활동의 설명 할 수없는 경향)의 큰 주파수를 확인합니다. 그들은 세포 생존을 adulterating없이 신호 샘플링을 가능으로, 다른 한편으로는, 이러한 분비 luciferases은 운동 분석에 유용합니다. 여기에 제시된 연구를 위해, 우리는 동시에 세 개의 암 관련의 활동을 모니터링 할세포 과정 : p53의, 크라스, 그리고 Wnt의 신호 전달 경로. ,, 우리의 연구에 통합 기자 Clontech 사에서 pp53-TA-뤽 FL 기자 (이제부터는 p53의-FL 기자라고도 함) 8 Elk1-GAL4/UAS-CL 기자 시스템 (애질런트 이제부터는 엘크-1 기자)입니다 와 T-세포 인자 (또는 TCFS) 9-11로 알려진 Wnt의 경로 전사 규제에 의해 인식 여러 합성 증강 요소를 통합 8X TCF RL 기자.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PathDetect Elk1 Trans-Reporting System</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>219005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector</td>
			<td>Clontech Lab Inc.</td>
			<td>631914</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>301427</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega Corp.</td>
			<td>E1960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cypridina Luciferase Assay reagent</td>
			<td>Targeting Systems</td>
			<td>VLAR-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT116 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega Corp.</td>
			<td>G9260</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiFlo Microplate Dispenser</td>
			<td>Labsystems Inc.</td>
			<td>Model 832</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek FXP Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter Inc.</td>
			<td>A31842</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech Inc.</td>
			<td>0471-101A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Reichert Hemacytometers</td>
			<td>Hausser Scientific Company</td>
			<td>1490</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multiplexed luciferase-based screening platform for interrogating cancer-associated signal transduction in cultured cells

RNA 간섭 (RNAi의)를 사용하여 유전자 기능의 게놈 규모의 심문은 화학적으로 취급하기 쉬운 암 세포 취약점의 신속한 식별을위한 엄청난 약속을 보유하고 있습니다. 이 기술의 잠재력을 제한하면 신속하게 표현형 결과의 기계론의 기초를 묘사함으로써 분자 표적 치료 전략의 개발을 알리는 무능력이다. 우리는 주요 암 세포 관련 프로세스를 모니터링 할 수 있도록 다중 기자 시스템을 사용하여 대상 RNAi를 매개 유전자에 의한 세포의 표현형을 해체하기 위해 여기 방법을 설명합니다. 이 높은 콘텐츠 심사 방법은 다재다능하고 쉽게 큰 분자 라이브러리의 다른 종류의 검사를 위해 적용 할 수 있습니다.

대규모 게놈 시퀀싱 노력 12-14를 사용하여 다양한 암의 돌연변이 풍경을 매핑의 발전에도 불구하고, 우리는 여전히 그 자리에 개입 전략에 이러한 관측을 번역하기위한 체계적인 접근 방법을 가지고 있지 않습니다. / Wnt는 β-catenin 신호, p53의, 그리고 크라스 신호 - - 대장 암 (CRC), 세 가지 세포 프로세스의 구성 요소에 영향을 미칠 것으로 예상되는 돌연변이들은 창자의 세포 변화의 주요 ?...

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A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

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