Name: a multiplexed luciferase-based screening platform for interrogating cancer-associated signal transduction in cultured cells
Uploaded: 2013-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells at JoVE.com

Vi erkjenner finansiering støtte fra CPRIT (RP100119) og Welch Foundation (I-1665).

Hele protokollen tar ca 4 dager. En. Utarbeidelse av celler for siRNA og Reporter Transfection Vi vil introdusere her en protokoll for avhør siRNA bibliotekene ved hjelp av et lite sett med siRNAs (384 forskjellige siRNA bassenger array i 96 godt format med hver pool bestående av 4x siRNAs rettet mot et enkelt gen) fra et genom-wide siRNA bibliotek for veiledende. For denne studien, vil vi utnytte HCT116 celler som viser avvikende Wnt og Kras signalering, og p53 ...

<ol>
	<li>Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemiluminescent+and+bioluminescent+reporter+gene+assays.">Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays.</a> Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).</li><li>Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+luminescent+reporter+gene+assays.">Seeing the light: luminescent reporter gene assays.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).</li><li>McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+systems+in+Drosophila:+a+synthesis+of+time+and+space.">Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space.</a> Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).</li><li>Smirnova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Neh2-luciferase+reporter+and+its+application+for+high+throughput+screening+and+real-time+monitoring+of+Nrf2+activators.">Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators.</a> Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+disruption+of+Wnt-dependent+signaling+in+tissue+regeneration+and+cancer.">Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer.</a> Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).</li><li>Tang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+for+Wnt/beta-catenin+pathway+components+identifies+unexpected+roles+for+TCF+transcription+factors+in+cancer.">A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).</li><li>Lum, L. D., Kulak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Luciferase+Reporter+Assay+Systems.">Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems.</a> United States patent. , (2012).</li><li>Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptionally+active+DNA-binding+site+for+human+p53+protein+complexes.">A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes.</a> Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).</li><li>DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+the+Wnt-wingless+signaling+pathway.">Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway.</a> Science. 308, 826-833 (2005).</li><li>Korinek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+epithelial+stem-cell+compartments+in+the+small+intestine+of+mice+lacking+Tcf-4.">Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4.</a> Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).</li><li>Korinek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+members+of+the+Tcf+family+implicated+in+Wnt/beta-catenin+signaling+during+embryogenesis+in+the+mouse.">Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse.</a> Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+characterization+of+human+colon+and+rectal+cancer.">Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer.</a> Nature. 487, 330-337 (2012).</li><li>Koboldt, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. , (2012).</li><li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+landscapes+of+human+breast+and+colorectal+cancers.">The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+genome-wide+RNA+interference+screens.">Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens.</a> Science Signaling. 2, pt4 (2009).</li><li>Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+to+dissect+cellular+pathways:+a+how-to+guide.">High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide.</a> Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).</li><li>Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell-based+RNAi+screens.">Analysis of cell-based RNAi screens.</a> Genome Biology. 7, R66 (2006).</li><li>Gilbert, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multiplex+cell+viability+assay+for+high-throughput+RNAi+screening.">A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening.</a> PLoS ONE. 6, e28338 (2011).</li></ol>

Det er flere formidlere av luciferase-baserte reporter systemer (som Promega, målsystemer, New England Biolabs, og Thermo Fisher) som gir nyttige on-line ressurser for de underholdende en høy gjennomstrømming skjermen for første gang. I tillegg bør en rekke gode anmeldelser om å optimalisere bruken av high-throughput skjermer for genet funnet og hvordan RNAi-basert screening resultater kan integreres med andre-omics-baserte datasett være nyttig 15,16. Metoder for valg av &quot;treff&quot; fra high-thro...

En rekke luciferase-baserte journalister for å overvåke et variert utvalg av cellebiologiske prosesser er kommersielt tilgjengelig. De fleste av disse DNA konstruerer kode luciferase proteiner som er overtalt til å uttrykke av bestemte celle stimuli eller forstyrrelsene. Den mest robuste transcriptionally baserte journalister plasserer uttrykk for en luciferase enzymet under kontroll av syntetiske enhancer elementer eller genpromotoren regioner veletablerte for sin pålitelighet i rapporteringen en fysiologisk relevant transkripsjonell hendelsen 1,2. Det er også trans-reporter luciferase systemer som bruker Gal4-UAS å kjøre luciferase protein uttrykk. Gal4 er en gjær-transkripsjons-aktivator, og UAS er en enhancer som Gal4 spesifikt bindes å aktivere transkripsjon av gensekvenser plassert nedstrøms av den tre. Disse typer luciferase systemer er vanligvis støttet av to DNA-plasmider - en koder Gal4 protein smeltet til regulatoriskery del av et protein av interesse, og den andre koder for et protein som luciferase plassert under kontroll av en eller flere av UAS sekvenser. Således reflekterer den cellulære luciferase signal aktiviteten av proteinet av interesse. En annen vanlig bruk av luciferase-baserte reportere er for overvåkning av proteinstabilitet hvorved et protein av interesse er her koblet til en luciferase enzym 4.. Uavhengig av type reporter, er en forbeholdet emptor bemerket her som man ikke kan anta spesifisitet av noen reporter å ha vært godt avhørt. Dermed er due diligence som kreves i inkorporering av nye reporter konstruksjoner i noen forskningsstrategi. Valget av luciferase enzymet lese-out kan være like viktig som påliteligheten av DNA-elementer som styrer sitt uttrykk. Mens ildflue luciferase (FL) er den mest brukte enzym i kommersielt tilgjengelige konstruksjoner, framveksten av nye luciferase reporter systemer som ikke krever ATP (som i tilfelletav FL-baserte reaksjoner) eller at innlemme mer stabile enzymer som avgir sterkere signaler lover å forbedre effektiviteten og påliteligheten til denne forskningsplattform. Viktig merknad om valg av luciferase reportere i kjemiske studier er mottakelighet for FL til kjemisk hemming som kan gi opphav til falske rapporter. Vår erfaring er andre enzymer som Renilla eller Gaussia luciferase (RL og GL, henholdsvis) som utnytter coelenterazine som underlag er ikke så lett hemmet av små molekyler fem. Det vanligste formatet for multipleksing luciferase read-outs innebærer bruk av FL og RL i stor grad gitt tilgjengeligheten av lett-å-bruke kits med evnen til fortløpende måle enzymatiske aktiviteter fra en enkelt prøve. I de fleste kits det ut prøver først utsettes for luciferin for å avsløre nivåer av FL aktivitet etterfulgt av en bråkjøling reagens som blir samtidig avsatt med coelenterazine hvorved et s.dary RL signal. Med tillegg av andre luciferases som kan skilles ut som GL, eller at bruken enda et substrat som Cypridina luciferase (CL), et større antall muligheter for å generere høye innhold data ved hjelp luciferases har dukket opp. Et eksempel på et genom-wide RNAi skjermen ved hjelp av denne teknikken kan bli funnet her seks. Disse teknologiske fremskritt har i sin tur påvirket utviklingen av spesifikke mekanismer for å slukke hver type luciferase enzym for å begrense krysstale 7. I våre hender, ser vi en større frekvens av &quot;kanteffekter&quot; (uforklarlige trender i mobilnettet aktivitet forbundet med kanten av høye titer kultur plater), med utskilt luciferases som GL eller CL. På den annen side, slike utskilte luciferases er nyttige for kinetiske analyser som de klargjøringssignalet prøvetaking uten adulterating cellelevedyktighet. For vår studie presentert her, vil vi samtidig overvåke aktiviteten til tre kreft-relevantcellulære prosesser: p53, Kras, og Wnt signaltransduksjonsveiene. Journalistene innlemmet i vår studie er pp53-TA-Luc FL reporter fra Clontech (heretter kalt p53-FL reporter) 8, en Elk1-GAL4/UAS-CL reporter system (heretter Elk-1 reporter, Agilent), og 8X TCF RL reporter som inkorporerer flere syntetiske enhancer elementer anerkjent av Wnt veien transcriptional regulatorer som kalles T-celle faktorer (eller TCFs) 9-11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PathDetect Elk1 Trans-Reporting System</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>219005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector</td>
			<td>Clontech Lab Inc.</td>
			<td>631914</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>301427</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega Corp.</td>
			<td>E1960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cypridina Luciferase Assay reagent</td>
			<td>Targeting Systems</td>
			<td>VLAR-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT116 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega Corp.</td>
			<td>G9260</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiFlo Microplate Dispenser</td>
			<td>Labsystems Inc.</td>
			<td>Model 832</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek FXP Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter Inc.</td>
			<td>A31842</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech Inc.</td>
			<td>0471-101A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Reichert Hemacytometers</td>
			<td>Hausser Scientific Company</td>
			<td>1490</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multiplexed luciferase-based screening platform for interrogating cancer-associated signal transduction in cultured cells

Genom-skala avhør av gen-funksjon ved hjelp av RNA interferens (RNAi) har enorm løftet for rask identifisering av kjemisk medgjørlig kreftcelle sårbarheter. Begrenser potensialet i denne teknologien er manglende evne til raskt å avgrense det mekanistiske grunnlaget for fenotypiske utfall og dermed informere utviklingen av molekylært målrettede terapeutiske strategier. Vi skissere her metoder for å dekonstruere cellulære fenotyper indusert av RNAi-mediert gene targeting bruker multipleksede reporter systemer som tillater overvåking av nøkkelen kreftcelle-tilknyttede prosesser. Dette høye innhold screening-metoden er fleksibel og kan lett tilpasses for screening av andre typer store molekylære bibliotek.

Til tross for fremskritt i å kartlegge mutational landskapet av ulike kreftformer med massive genomsekvensering innsats 12-14, har vi fortsatt ikke har på plass en systematisk tilnærming for å oversette disse observasjonene i intervensjon strategier. I tykk-og endetarmskreft (CRC), mutasjoner som er spådd å påvirke komponenter i tre cellulære prosesser - Wnt / β-catenin, p53, og Kras signalering - er funnet i 99% av alle svulster som tyder på at de er sentrale drivere av mobilnettet transformasjon i...

Watch this Scientific Journal Video about A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells at JoVE.com

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Oppnå et system nivå forståelse av cellulære prosesser er et mål for dagens cellebiologi. Vi beskriver her strategier for multipleksing luciferase reportere i ulike cellular funksjon endepunkter å avhøre gen-funksjon ved hjelp av genom-skala RNAi biblioteker.

En Multiplexed Luciferase-basert screening plattform for avhør kreft-assosiert Signal Transduksjon i dyrkede celler

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Research

JoVE Journal

Medicine

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

How to Measure kortikal Folding fra MR bilder: en Step-by-Step Tutorial å beregne Local Gyrification Hovedsiden

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Høyt innhold Screening i nevrodegenerative sykdommer

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Screening for Melanom Modifiers ved hjelp av en Sebrafisk stedegen Tumor Model

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Voluntary Breath-hold Technique for Reducing Heart Dose in Left Breast Radiotherapy

Frivillig Breath-hold Teknikk for å redusere hjerte Dose i venstre bryst Strålebehandling

Breath-holding techniques reduce the amount of radiation received by cardiac structures during tangential-field left breast radiotherapy. With these ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Carotisar infusjoner for farmakokinetiske og farmakodynamiske Analyse av Taxaner i Mus

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studerer Bukspyttkjertelkreft Stem Cell Kjennetegn for å utvikle nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

A High-content In Vitro Pancreatic Islet ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Replication Discovery Platform

En High-innhold<em&gt; In Vitro</em&gt; Bukspyttkjertelen Islet β-celle Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

Screening av bioaktive nanopartikler i phagocytiske immunceller for inhibitorer av Toll-lignende Receptor Signalering

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Rutine Screening metode for Microparticles i blodplater blodoverføringer

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...