Name: a multiplexed luciferase-based screening platform for interrogating cancer-associated signal transduction in cultured cells
Uploaded: 2013-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells at JoVE.com

Reconhecemos o apoio financeiro do CPRIT (RP100119) e da Fundação Welch (I-1665).

Protocolo inteiro leva cerca de 4 dias. 1. Preparação de células para siRNA e Reporter transfecção Vamos introduzir aqui um protocolo para interrogar bibliotecas de siRNA usando um pequeno conjunto de siRNAs (384 matriz diferente piscinas siRNA em formato de 96 poços com cada conjunto constituído por siRNAs 4x destinada a um único gene) a partir de uma biblioteca de siRNA de todo o genoma para fins ilustrativos. Para este estudo particular, vamos explorar H...

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	<li>Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemiluminescent+and+bioluminescent+reporter+gene+assays.">Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays.</a> Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).</li><li>Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+luminescent+reporter+gene+assays.">Seeing the light: luminescent reporter gene assays.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).</li><li>McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. 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Existem vários fornecedores de sistemas repórter baseados em luciferase (tais como Promega, Targeting Systems, New England Biolabs, e Thermo Fisher) que fornecem úteis recursos on-line para aqueles entreter uma tela de alto rendimento para a primeira vez. Além disso, uma série de excelentes comentários sobre a otimização do uso de telas de alto rendimento para a descoberta dos genes e como baseada em RNAi resultados de rastreio pode ser integrado com conjuntos de dados-omics baseados outro deve ser útil 15...

Uma variedade de repórteres de luciferase de base para monitorizar uma matriz diversificada de processos biológicos celulares estão comercialmente disponíveis. A maioria destas construções de ADN que codificam proteínas de luciferase são induzidas para expressar por estímulos específicos de células ou perturbações. Os sólidos repórteres maioria baseados na transcrição colocar a expressão de uma enzima da luciferase sob o controlo de elementos potenciadores sintéticos ou regiões promotoras de genes bem estabelecidos para a sua fiabilidade em um relato de eventos de transcrição 1,2 fisiologicamente relevante. Há também sistemas de trans-repórter de luciferase que utilizam GAL4-UAS para dirigir a expressão da proteína luciferase. Gal4 é um activador da transcrição de levedura e as UAS é um potenciador para o qual se liga especificamente Gal4 para activar a transcrição de sequências de genes colocados a jusante do mesmo 3. Estes tipos de sistemas de luciferase são tipicamente suportado por dois plasmídeos de ADN - uma codifica a proteína GAL4 fundido com o regulatory porção de uma proteína de interesse e o segundo codifica uma proteína da luciferase colocado sob o controlo de uma ou mais sequências UAS. Assim, o sinal de luciferase celular reflecte o nível da actividade da proteína de interesse. Outra utilização comum de repórteres de luciferase de base é para monitorizar a estabilidade da proteína em que uma proteína de interesse é fundida a uma enzima luciferase 4. Independentemente do tipo de repórter, um caveat.emptor é notado aqui como não se pode assumir a especificidade de qualquer repórter ter sido bem interrogados. Assim, due diligence é necessária a incorporação de novas construções repórter em qualquer estratégia de pesquisa. A selecção da enzima luciferase a leitura pode ser tão importante como a fiabilidade dos elementos de DNA que controlam a sua expressão. Considerando que a luciferase do pirilampo (FL) é a enzima mais utilizada em construções comercialmente disponíveis, o advento de novos sistemas de repórter da luciferase que não necessitam de ATP (como no casode reações baseadas FL) ou que incorporem enzimas mais estáveis ​​que emitem sinais mais fortes prometem melhorar a eficiência ea confiabilidade desta plataforma de pesquisa. Uma nota importante sobre a selecção de repórteres de luciferase em estudos químicos é a susceptibilidade de FL para inibição química que poderia dar origem a relatórios falsos. Na nossa experiência, outras enzimas, tais como a luciferase de Renilla, ou Gaussia (RL e GL, respectivamente), que utilizam como substrato coelenterazina são menos facilmente inibidas por moléculas pequenas 5. O formato mais comum para multiplexação de luciferase leia-outs implica a utilização de FL e RL, em grande parte devido à disponibilidade de fácil de usar kits com a capacidade de medir actividades enzimáticas sequencialmente a partir de uma única amostra. Na maioria dos jogos, as amostras são expostos primeiro a luciferina para revelar os níveis de actividade FL seguido por um reagente de extinção que é depositado simultaneamente com coelenterazina para originar um em segundasinal RL dary. Com a adição de outras luciferases de que podem ser segregadas, tais como GL ou que o uso de um outro substrato, tal como a luciferase Cypridina (CL), um maior número de possibilidades para a geração de dados de conteúdos elevados utilizando luciferases emergiram. Um exemplo de uma tela de RNAi do genoma usando esta técnica pode ser encontrada aqui 6. Estes avanços tecnológicos têm por sua vez, estimulou o desenvolvimento de mecanismos específicos para extinguir cada tipo de enzima luciferase a fim de limitar a conversa cruzada 7. Em nossas mãos, notamos uma maior freqüência de &quot;efeitos de borda&quot; (tendências inexplicáveis ​​na atividade celular associada à beira de placas de cultura de alta titulação), com luciferases secretadas como GL ou CL. Por outro lado, tais luciferases secretadas são úteis para ensaios cinéticos, pois permitem a amostragem do sinal sem adulterar a viabilidade celular. Para o nosso estudo apresentado aqui, vamos monitorar simultaneamente a atividade de três câncer relevanteprocessos celulares: o p53, Kras, e vias de sinalização Wnt. Os repórteres incorporados no nosso estudo são a FL repórter PP53-TA-Luc de Clontech (doravante referido como o repórter p53-FL) 8, um sistema repórter Elk1-GAL4/UAS-CL (doravante, Elk-1 repórter; Agilent), eo 8X TCF RL repórter que incorpora vários elementos potenciador sintéticos reconhecidos pela via Wnt reguladores de transcrição, conhecidos como fatores de células T (ou TCFs) 9-11.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PathDetect Elk1 Trans-Reporting System</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>219005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector</td>
			<td>Clontech Lab Inc.</td>
			<td>631914</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>301427</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega Corp.</td>
			<td>E1960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cypridina Luciferase Assay reagent</td>
			<td>Targeting Systems</td>
			<td>VLAR-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT116 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega Corp.</td>
			<td>G9260</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiFlo Microplate Dispenser</td>
			<td>Labsystems Inc.</td>
			<td>Model 832</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek FXP Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter Inc.</td>
			<td>A31842</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech Inc.</td>
			<td>0471-101A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Reichert Hemacytometers</td>
			<td>Hausser Scientific Company</td>
			<td>1490</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multiplexed luciferase-based screening platform for interrogating cancer-associated signal transduction in cultured cells

Interrogatório da função do gene usando RNA de interferência (RNAi) genoma escala detém uma grande promessa para a rápida identificação de vulnerabilidades de células de câncer quimicamente tratáveis. Limitar o potencial desta tecnologia é a incapacidade de delinear rapidamente a base mecanicista de resultados fenotípicos e, assim, informar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas molecularmente alvo. Nós delineamos aqui métodos para desconstruir fenótipos celulares induzidas pelo gene RNAi mediado alvo usando sistemas repórter multiplexados que permitem a monitorização do câncer de processos-chave associados a células. Esta metodologia de rastreio de alto conteúdo é versátil e pode ser facilmente adaptado para o rastreio de outros tipos de grandes bibliotecas moleculares.

Apesar dos avanços no mapeamento da paisagem mutacional de vários tipos de câncer usando enormes esforços de seqüenciamento do genoma 12-14, ainda não tem em lugar de uma abordagem sistemática para traduzir estas observações em estratégias de intervenção. No câncer colorretal (CRC), as mutações que estão previstos para afetar os componentes de três processos celulares - Wnt / β-catenina, p53, e Kras sinalização - são encontrados em 99% de todos os tumores, sugerindo que eles são fatores-...

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A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Alcançar um nível de compreensão dos processos celulares de sistemas é uma meta da biologia celular moderna. Descrevemos aqui as estratégias para jornalistas luciferase multiplexação de várias funções celulares de pontos finais para interrogar a função do gene usando genoma escala bibliotecas RNAi.

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

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