Name: a multiplexed luciferase-based screening platform for interrogating cancer-associated signal transduction in cultured cells
Uploaded: 2013-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells at JoVE.com

Vi erkänner finansieringsstöd från CPRIT (RP100119) och Welch Foundation (I-1665).

Hela protokollet tar cirka 4 dagar. Ett. Beredning av celler för siRNA och Reporter Transfection Vi kommer att presentera här ett protokoll för förhör siRNA-bibliotek med hjälp av en liten uppsättning av siRNA (384 olika siRNA pooler array i 96 väl format med varje pool bestående av 4x siRNA riktade en enda gen) från en genomet hela siRNA-bibliotek är illustrativ. För denna studie kommer vi att utnyttja HCT116 celler som uppvisar avvikande Wnt och Kras ...

<ol>
	<li>Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemiluminescent+and+bioluminescent+reporter+gene+assays.">Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays.</a> Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).</li><li>Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+luminescent+reporter+gene+assays.">Seeing the light: luminescent reporter gene assays.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).</li><li>McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+systems+in+Drosophila:+a+synthesis+of+time+and+space.">Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space.</a> Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).</li><li>Smirnova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Neh2-luciferase+reporter+and+its+application+for+high+throughput+screening+and+real-time+monitoring+of+Nrf2+activators.">Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators.</a> Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+disruption+of+Wnt-dependent+signaling+in+tissue+regeneration+and+cancer.">Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer.</a> Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).</li><li>Tang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+for+Wnt/beta-catenin+pathway+components+identifies+unexpected+roles+for+TCF+transcription+factors+in+cancer.">A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).</li><li>Lum, L. D., Kulak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Luciferase+Reporter+Assay+Systems.">Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems.</a> United States patent. , (2012).</li><li>Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptionally+active+DNA-binding+site+for+human+p53+protein+complexes.">A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes.</a> Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).</li><li>DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+the+Wnt-wingless+signaling+pathway.">Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway.</a> Science. 308, 826-833 (2005).</li><li>Korinek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+epithelial+stem-cell+compartments+in+the+small+intestine+of+mice+lacking+Tcf-4.">Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4.</a> Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).</li><li>Korinek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+members+of+the+Tcf+family+implicated+in+Wnt/beta-catenin+signaling+during+embryogenesis+in+the+mouse.">Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse.</a> Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+characterization+of+human+colon+and+rectal+cancer.">Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer.</a> Nature. 487, 330-337 (2012).</li><li>Koboldt, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. , (2012).</li><li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+landscapes+of+human+breast+and+colorectal+cancers.">The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+genome-wide+RNA+interference+screens.">Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens.</a> Science Signaling. 2, pt4 (2009).</li><li>Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+to+dissect+cellular+pathways:+a+how-to+guide.">High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide.</a> Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).</li><li>Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell-based+RNAi+screens.">Analysis of cell-based RNAi screens.</a> Genome Biology. 7, R66 (2006).</li><li>Gilbert, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multiplex+cell+viability+assay+for+high-throughput+RNAi+screening.">A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening.</a> PLoS ONE. 6, e28338 (2011).</li></ol>

Det finns flera leverantörer av luciferas-baserade rapporteringssystem (t.ex. Promega, identifieringssystem, New England Biolabs, och Thermo Fisher) som ger användbara resurser på nätet för dem som underhållande en hög genomströmning skärm för första gången. Dessutom bör ett antal utmärkta recensioner om att optimera användningen av high-throughput skärmar för gen upptäckt och hur RNAi screening resultat kan integreras med andra-genomik-baserade datamängder vara användbart 15,16. Metoder f...

En mängd av luciferas-baserade reportrar för övervakning av en mångfald av cellbiologiska processer är kommersiellt tillgängliga. Majoriteten av dessa DNA-konstruktioner kodar luciferasenheter proteiner som induceras att uttrycka med specifika celler stimuli eller perturbationer. Den mest robusta transkriptionellt baserade reportrar placera ett uttryck för en luciferasenzym under kontroll av syntetiska enhancerelement eller gen promotorregioner väl etablerade för sin tillförlitlighet i rapporteringen en fysiologiskt relevant transkriptionell händelsen 1,2. Det finns också trans-reporter luciferas system som använder GAL4-UAS att driva luciferasprotein uttryck. Gal4 är en jäst transkriptionell aktivator och UAS är en förstärkare till vilken Gal4 specifikt binder till aktivera transkriptionen av gensekvenser placerade nedströms av det 3. Dessa typer av luciferas system typiskt stöds av två DNA-plasmider - en kodar för GAL4-proteinet sammansmält med reglerandery del av ett protein av intresse, och den andra kodar en luciferasprotein placeras under kontroll av en eller flera UAS sekvenser. Således speglar den cellulära luciferas signalen aktivitetsnivån av proteinet av intresse. En annan vanlig användning av luciferas-baserade reportrar är för övervakning proteinstabilitet varigenom ett protein av intresse är sammansmält med en luciferasenzym 4. Oavsett vilken typ av reportern, är en varning emptor noteras här som man inte kan ta på specificitet någon reporter att ha väl förhörts. Således är due diligence krävs i införlivandet av nya reporterkonstruktioner i någon forskningsstrategi. Valet av luciferasenzymet utläsning kan vara lika viktig som tillförlitligheten hos de DNA-element som kontrollerar dess expression. I eldflugeluciferas (FL) är den mest använda enzym i kommersiellt tillgängliga konstruktioner, tillkomsten av nya luciferas reporter system som inte kräver ATP (som i falletav FL-baserade reaktioner) eller att införliva mer stabila enzymer som sänder starkare signaler lovar att förbättra effektiviteten och tillförlitligheten i denna forskningsplattform. En viktig anmärkning om urvalet av luciferas reportrar i kemiska studier är mottagligheten för FL till kemisk hämning som kan ge upphov till falska rapporter. Enligt vår erfarenhet, andra enzymer såsom Renilla eller Gaussia luciferas (RL och GL, respektive) som utnyttjar coelenterazin som ett substrat är mindre lätt inhiberas av små molekyler 5. Det vanligaste formatet för multiplexing luciferasenheter avläsningar innebär användning av FL och RL stor del med tanke på tillgången på lätt-till-använda kit med förmågan att sekventiellt mäta enzymatiska aktiviteter från ett enda prov. I de flesta kit, prover först utsätts för luciferin att avslöja nivåer av FL aktivitet följt av en släckningsreagens som samtidigt är deponerade hos coelenterazin att ge en SeconDary RL signal. Med tillägg av andra luciferaser som kan utsöndras såsom GL eller att använda ännu ett substrat såsom Cypridina luciferas (CL), ett större antal möjligheter för att generera höga innehåll data med luciferaser har uppstått. Ett exempel på en genomet hela RNAi skärm med den här tekniken kan hittas här 6. Dessa tekniska framsteg har i sin tur drivit på utvecklingen av särskilda mekanismer för att släcka varje typ av luciferasenzym för att begränsa överhörning 7. I våra händer, noterar vi en ökad frekvens av &quot;kanteffekter&quot; (oförklarliga trender i cellulär aktivitet associerad med kanten på höga tallrikar titer kultur), med utsöndrade luciferaser såsom GL eller CL. Å andra sidan, sådana utsöndrade luciferaser är användbara för kinetiska analyser eftersom de möjliggör signalsampling utan förvanskande cellviabilitet. För vår studie som presenteras här, kommer vi att följa samtidigt aktiviteten av tre cancer-relevantcellulära processer: p53, Kras, och Wnt signalvägar transduktion. De reportrar som ingår i vår studie är den pp53-TA-Luc FL reporter från Clontech (hädanefter kallat p53-FL reporter) 8, ett Elk1-GAL4/UAS-CL reportersystem (hädanefter Elk-1 reporter, Agilent), och 8X TCF RL reporter som innehåller flera syntetiska enhancerelement erkänns av den Wnt banan transkriptionsregulatorer kallas T-cell-faktorer (eller TCFS) 9-11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PathDetect Elk1 Trans-Reporting System</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>219005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector</td>
			<td>Clontech Lab Inc.</td>
			<td>631914</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen Inc.</td>
			<td>301427</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega Corp.</td>
			<td>E1960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cypridina Luciferase Assay reagent</td>
			<td>Targeting Systems</td>
			<td>VLAR-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT116 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega Corp.</td>
			<td>G9260</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiFlo Microplate Dispenser</td>
			<td>Labsystems Inc.</td>
			<td>Model 832</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek FXP Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter Inc.</td>
			<td>A31842</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech Inc.</td>
			<td>0471-101A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Reichert Hemacytometers</td>
			<td>Hausser Scientific Company</td>
			<td>1490</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multiplexed luciferase-based screening platform for interrogating cancer-associated signal transduction in cultured cells

Genome-skala förhör av geners funktion med hjälp av RNA-interferens (RNAi) är en stark kandidat för snabb identifiering av kemiskt tractable sårbarheter cancercell. Att begränsa möjligheterna för denna teknik är oförmågan att snabbt avgränsa mekanistiska grunden för fenotypiska utfall och därmed informera om utvecklingen av molekylärt riktade terapeutiska strategier. Vi skisserar här metoder för att dekonstruera cellulära fenotyper inducerade av RNAi-medierad genmålinriktning använda multiplexade reporter system som tillåter övervakning av nyckel cancercell-associerade processer. Denna höga halt screening metodiken är mångsidig och kan lätt anpassas för screening av andra typer av stora molekylära bibliotek.

Trots framsteg inom kartlägga mutational landskap av olika cancerformer med massiva insatser genomsekvensering 12-14, vi fortfarande inte har infört ett systematiskt tillvägagångssätt för att översätta dessa observationer i insatsstrategier. I kolorektal cancer (CRC), mutationer som förutspås påverka delar av tre cellulära processer - Wnt / β-catenin, p53, och Kras signalering - finns i 99% av alla tumörer tyder på att de är viktiga drivkrafter för cellulär transformation i tarmen 13.</...

Watch this Scientific Journal Video about A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells at JoVE.com

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Att uppnå en systemnivå förståelse av cellulära processer är ett mål i dagens cellbiologi. Vi beskriver här strategier för multiplexing luciferasenheter reportrar av olika cellfunktioner slutpunkter att förhöra geners funktion med hjälp av genomet skala RNAi biblioteken.

En Multiplex Luciferas screening plattform för Förhöra cancer-associerade Signaltransduktion i odlade celler

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Research

JoVE Journal

Medicine

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Hur man mäter Bark Folding från MR bilder: en steg-för-steg anvisning för att beräkna lokala Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Hög halt Screening vid neurodegenerativa sjukdomar

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

Användning av cystometri i smågnagare: En studie av urinblåsan Chemosensation

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Screening för melanom Modifieringar med en Zebrafish Autoktont tumörmodell

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Voluntary Breath-hold Technique for Reducing Heart Dose in Left Breast Radiotherapy

Frivillig Breath-hold Teknik för att minska Heart Dos i vänster bröst Strålbehandling

Breath-holding techniques reduce the amount of radiation received by cardiac structures during tangential-field left breast radiotherapy. With these ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Halspulsådern Tinkturer för farmakokinetiska och farmakodynamiska Analys av taxaner i möss

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studera bukspottkörtelcancer Stem Cell egenskaper för att utveckla nya behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

A High-content In Vitro Pancreatic Islet ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Replication Discovery Platform

En hög halt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-cell replikering Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

Screening av bioaktiva nanopartiklar i phagocytiska immunceller för inhibitorer av Toll-liknande Receptorsignalering

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Rutinmässig Screening metod för mikropartiklar i trombocyttransfusioner

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...