Name: efficient and rapid isolation of early-stage embryos from arabidopsis thaliana seeds
Uploaded: 2013-06-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Tal Nawy e Martin Bayer per i loro consigli su isolamento embrione. MTR, VG, UG e CB inventato l&#39;attrezzatura isolamento embrione. MTR, VG e CB sviluppato il protocollo di isolamento embrione. MTR, VG e CB stabilito il protocollo, isolati gli embrioni, e embrione generato cDNA, VG eseguito la PCR, MTR la colorazione GUS, JJ esperimenti il ​​pesce. MTR, VG, CG e UG ha scritto il manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dall&#39;Università di Zurigo, una borsa di studio della Fondazione per la Ricerca Roche (a MTR), e sovvenzioni dal Fondo nazionale svizzero (di UG e CB).

La procedura è riassunto nel diagramma di flusso mostrato in Figura 1. Il microcapillari e il setup strumentale sono mostrati in Figura 2 e Figura 3, e fasi tipiche di isolamento embrioni sono mostrati in Figura 4. 1. Materiale e Buffer Preparazione 1.1 Silicon rivestimento di vetro microcapillari <ol><li> Collocare il microcapillari in una provetta Falcon 15 con ~ 5 ml di Sigmacote (Sigma) e cap...

<ol>
	<li>Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+demethylation+of+repetitive+elements+during+seed+development+underlies+gene+imprinting.">Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting.</a> Science. 324, 1447-1451 (2009).</li><li>Muller, B., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinin+and+auxin+interaction+in+root+stem-cell+specification+during+early+embryogenesis.">Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis.</a> Nature. 453, 1094-1097 (2008).</li><li>Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+parent-of-origin+allelic+expression+in+Arabidopsis+thaliana+seeds.">Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds.</a> PLoS One. 6, 23687-23 (2011).</li><li>Xiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+gene+expression+and+metabolic+network+dynamics+during+embryo+development+in+Arabidopsis.">Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).</li><li>Nawy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GATA+factor+HANABA+TARANU+is+required+to+position+the+proembryo+boundary+in+the+early+Arabidopsis+embryo.">The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 19, 103-113 (2010).</li><li>Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triploid+endosperm+genome+of+Arabidopsis+adopts+a+peculiar,+parental-dosage-dependent+chromatin+organization.">The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization.</a> Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).</li><li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145, 707-719 (2011).</li><li>Wohrmann, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+DNA+methylation-independent+imprinting+control+region+at+the+Arabidopsis+MEDEA+locus.">Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus.</a> Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).</li><li>Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+Flexibility+of+Genomic+Imprinting+during+Seed+Development.">Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development.</a> Plant Cell. 23, 16-26 (2011).</li><li>Rea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+DNA+methylation+of+imprinted+genes+in+Arabidopsis+endosperm.">Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm.</a> J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).</li><li>Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+WOX+genes+mediates+apical-basal+axis+formation+in+the+Arabidopsis+embryo.">Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 14, 867-876 (2008).</li><li>Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana+MEDEA+Polycomb+group+protein+controls+expression+of+PHERES1+by+parental+imprinting.">The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting.</a> Nature. 37, 28-30 (2005).</li><li>Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate.">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).</li><li>Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+single+cells.">Transcriptome analysis of single cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).</li><li>Nodine, M. D., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+and+paternal+genomes+contribute+equally+to+the+transcriptome+of+early+plant+embryos.">Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos.</a> Nature. 482 (7383), (2012).</li><li>Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fusions:+beta-glucuronidase+as+a+sensitive+and+versatile+gene+fusion+marker+in+higher+plants.">fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.</a> EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).</li><li>Schmidt, A., W&#246;hrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+group+protein+MEDEA+and+the+DNA+methyltransferase+MET1+interact+in+Arabidopsis+to+repress+autonomous+endosperm+development.">The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development.</a> Plant J. 73 (5), (1111).</li></ol>

Abbiamo sviluppato un protocollo di isolamento embrione che è rapido, efficace, e possono essere facilmente trasferiti ad altri laboratori. L&#39;apparecchiatura descritta qui consiste di un microscopio invertito, un micromanipolatore, vetro microcapillari, un estrattore verticale filamento e un microinjector (Figura 3A). La configurazione è simile a quella descritta per l&#39;isolamento singola cellula animale per transcrittomica analisi 17. Abbiamo anche lavor...

L&#39;embrione di piante da fiore è circondato dal endosperma, un tessuto nutritivo derivato da un secondo evento fecondazione. Sia dell&#39;embrione e dell&#39;endosperma sono circondati da diversi strati di cellule del tegumento. Collettivamente questi tessuti formano un seme, che si sviluppano all&#39;interno del frutto. Così, tessuti e cellule specifiche analisi di embrioni di Arabidopsis sono fortemente compromesse a causa della loro inaccessibilità. Ciò nonostante, gli embrioni nelle fasi tardo-globulari o poi sono relativamente ben suscettibili di dissezione manuale utilizzando aghi sottili di tungsteno con lo stereomicroscopio, o applicando una leggera pressione sul seme con pinze per estrarre loro. Tali tecniche sono state utilizzate con successo per l&#39;analisi del trascrittoma o profilazione epigenoma come ibridazione di microarray, sequenziamento bisolfito, o RNA sequenza (ad esempio 1-3). Al contrario, gli studi di embrioni allo stadio di zigote globulare precoce restano tecnicamente impegnativo. Ad oggi, solo pochi studi hanno reported analisi trascrittoma sui giovani embrioni utilizzando sia microdissezione laser-capture (LCM) di tessuti embrionali di sezioni semi fissi 4 o estrazione manuale di singoli embrioni da dentro i semi utilizzando strumenti raffinati 5. Tuttavia, attrezzature LCM non è comunemente disponibile e l&#39;estrazione manuale embrione nelle fasi iniziali in termini di tempo e che richiedono ottime capacità di dissezione che non sono facilmente trasferibili. Oltre alle analisi genome-wide, analisi in situ di espressione genica sono anche difficili da eseguire sui giovani, tutto il montaggio embrioni di Arabidopsis. In una certa misura, i giovani embrioni possono essere rilasciati su vetrini da microscopio con una leggera pressione sui semi e utilizzati per i saggi reporter gene o il rilevamento di proteine ​​di immunoistochimica (per esempio vedi 6,7). Questa tecnica, tuttavia, non consente l&#39;isolamento embrione ad alta produttività, ostacolando analisi quantitative. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo efficiente e rapidaper l&#39;isolamento embrione precoce dai semi di Arabidopsis che è semplice da installare, facilmente trasferibile, e adatto per una varietà di applicazioni a valle. Il principio di base è quello di schiacciare delicatamente i semi - sezionato da giovani silique in una provetta Eppendorf con un pestello di plastica in un buffer di isolamento adeguato. L&#39;estratto di semi viene posto in goccioline in una diapositiva multi-pozzetto ed esaminato per la presenza di embrioni rilasciate nella fase desiderata utilizzando un microscopio invertito. Gli embrioni sono raccolti utilizzando un bicchiere microcapillare attaccato ad un microinjector o una pipetta di laboratorio standard. Per applicazioni molecolari, gli embrioni vengono lavati due volte mediante ripetute rilascio in gocce di nuovo buffer isolamento prima di trasferirli al buffer di destinazione in un volume minimo. Per le applicazioni citologici (saggi di giornalista, immunoistochimica, FISH), fasi di lavaggio possono essere omessi. Il metodo offre numerosi vantaggi: (i) cede 25-40 embrioni in ~ 45 min per app citologicacazioni o in 3-4 hr per applicazioni molecolari (comprese le fasi di lavaggio), (ii) permette l&#39;isolamento degli stadi embrionali specifici, (iii) è facilmente trasferibile ad altre persone e laboratori grazie alla sua semplice configurazione, (iv) richiede attrezzature conveniente per la configurazione di base che è suscettibile di aggiornamenti, e (v) è stato utilizzato con successo per varie applicazioni a valle come RNA sequenziamento 8, gene-specifico DNA-metilazione analisi 9, saggi Reporter (10 e Raissig et al., in prep.) e FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux inedito, vedi figura 5).

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>SIGMA </td>
 <td>SL2-100 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse OUT</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>10777-019</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>First- strand buffer</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>18064-022</td>
 <td>contained in Superscript II package</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>18064-022</td>
 <td>contained in Superscript II package</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml </td>
 <td>New England Biolabs Inc.</td>
 <td></td>
 <td>Different suppliers will also work </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thin wall Capillaries 1.0 mm</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>TW100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNA LoBind tube 0.5 ml</td>
 <td>Vaudaux-Eppendorf</td>
 <td>0030108.035</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTrics&Delta; 30 &mu;m</td>
 <td>PARTEC</td>
 <td>04-0042-2316</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5wells 10 mm diameter slides</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>63421-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde Solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F1635</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost Plus slide</td>
 <td>Thermo Fisher</td>
 <td>J1800AMNZ</td>
 <td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris</td>
 <td>Amaresco</td>
 <td>0497</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Applichem</td>
 <td>A2937</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycin</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>50050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SDS pellets</td>
 <td>Roth</td>
 <td>CN30.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Pestle</td>
 <td>VWR</td>
 <td>431-0094</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microfine insulin syringes</td>
 <td>BD</td>
 <td>U-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D5758</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Schaurlau</td>
 <td>ET00102500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forceps N5</td>
 <td>Dumont</td>
 <td>0108-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bioanalyzer Pico Chip</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted microscope</td>
 <td>Nikon TMS (Japan),</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micromanipulator</td>
 <td>Leitz</td>
 <td></td>
 <td>Leica</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micomanipulator Post mount LH1 probe</td>
 <td>Leica microsystems</td>
 <td>39430101</td>
 <td>Different brand will also do the work</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vertical filament puller</td>
 <td>Sutter instrument</td>
 <td>P-20 model</td>
 <td>Other model are also suitable </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell Tram vario</td>
 <td>Vaudaux-Eppendorf</td>
 <td>5176.000.033</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>2100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qubit Fluorometer</td>
 <td>Invitrogen (life technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

efficient and rapid isolation of early-stage embryos from arabidopsis thaliana seeds

In piante da fiore, l&#39;embrione si sviluppa all&#39;interno di un tessuto nutriente - l&#39;endosperma - circondato dai tegumenti seminali materni (o tegumento). Come conseguenza, l&#39;isolamento di embrioni vegetali nelle fasi (1 cellula per stadio globulare) è tecnicamente difficile a causa della loro relativa inaccessibilità. Efficiente dissezione manuale a stadi precoci è fortemente compromessa dalla piccola dimensione di giovani semi di Arabidopsis e l&#39;adesività dell&#39;embrione ai tessuti circostanti. Qui, descriviamo un metodo che permette l&#39;isolamento efficiente di giovani embrioni di Arabidopsis, cedendo fino a 40 embrioni in 1 ora a 4 ore, a seconda dell&#39;applicazione a valle. Gli embrioni vengono rilasciati nel buffer di isolamento di poco schiacciamento 250-750 semi con un pestello di plastica in una provetta Eppendorf. Un bicchiere microcapillare collegato a entrambi una pipetta di laboratorio standard (tramite un tubo di gomma) o di un microinjector comando idraulico viene utilizzato per raccogliere gli embrioni da luogo gocciolined su una diapositiva multi-pozzetto su un microscopio a luce invertita. Le competenze tecniche richieste sono semplici e facilmente trasferibili, e l&#39;impostazione di base non richiede attrezzature costose. Gli embrioni raccolti sono adatti per una varietà di applicazioni a valle, come la RT-PCR, l&#39;RNA sequenziamento, analisi di metilazione del DNA, ibridazione in situ fluorescente (FISH), immunoistochimica, e saggi di geni reporter.

Nostra procedura di isolamento embrione (Figura 1) consente l&#39;isolamento di fino a 40 embrioni in 4 ore se lavaggi vengono eseguiti, ad esempio per applicazioni molecolari, o in meno di un&#39;ora se lavaggi sono omessi, ad esempio per applicazioni citologici. Figura 2 visualizza alta e bassa punte microcapillari qualità e la Figura 3 mostra la configurazione della macchina isolamento embrione. Figura 4 mostra il processo di isola...

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Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Riportiamo un metodo semplice ed efficace per isolare gli embrioni nelle prime fasi di sviluppo da<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semi. Fino a 40 embrioni possono essere isolati in 1 ora a 4 ore, a seconda dell&#39;applicazione a valle. La procedura è adatta per transcriptome, metilazione del DNA, l&#39;espressione del gene reporter, immunostaining e fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Analisi di ibridazione.

Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semi

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