Name: efficient and rapid isolation of early-stage embryos from arabidopsis thaliana seeds
Uploaded: 2013-06-07T13:00:00
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우리는 배아 분리에 대한 자신의 조언을 탈 Nawy 마틴 바이어에게 감사의 말씀을 전합니다. MTR, VG, UG와 CB는 배아 분리 장비를 고안했다. MTR, VG와 CB는 배아 분리 프로토콜을 개발했다. MTR, VG와 CB는 프로토콜을 확립 배아를 격리하고, 생성 된 배아의 cDNA, VG는 PCR, MTR GUS 염색, JJ 물고기 실험을 수행 하였다. MTR, VG, CG 및 UG는 원고를 썼다. 이 작품은 취리히 대학교, 로슈 연구 재단 (MTR까지)의 친목 및 스위스 국립 재단 (UG와 CB까지)에서 교부금에 의해 투자되었다.

절차는 그림 1의 순서도에 요약되어 있습니다. microcapillaries과 악기 설정은 그림 2와 그림 3에 표시되고, 배아 분리의 일반적인 단계는 그림 4에 표시됩니다. 1. 재료 및 버퍼 준비 유리 microcapillaries 1.1 실리콘 코팅 <ol><li> Sigmacote (시그마)의 ~ 5 ml의 15 ML 팔콘 튜브에 microcapillaries를 놓고 여러 번 반전. </li><li> 용액을 제?...

<ol>
	<li>Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+demethylation+of+repetitive+elements+during+seed+development+underlies+gene+imprinting.">Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting.</a> Science. 324, 1447-1451 (2009).</li><li>Muller, B., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinin+and+auxin+interaction+in+root+stem-cell+specification+during+early+embryogenesis.">Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis.</a> Nature. 453, 1094-1097 (2008).</li><li>Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+parent-of-origin+allelic+expression+in+Arabidopsis+thaliana+seeds.">Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds.</a> PLoS One. 6, 23687-23 (2011).</li><li>Xiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+gene+expression+and+metabolic+network+dynamics+during+embryo+development+in+Arabidopsis.">Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).</li><li>Nawy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GATA+factor+HANABA+TARANU+is+required+to+position+the+proembryo+boundary+in+the+early+Arabidopsis+embryo.">The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 19, 103-113 (2010).</li><li>Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triploid+endosperm+genome+of+Arabidopsis+adopts+a+peculiar,+parental-dosage-dependent+chromatin+organization.">The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization.</a> Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).</li><li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145, 707-719 (2011).</li><li>Wohrmann, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+DNA+methylation-independent+imprinting+control+region+at+the+Arabidopsis+MEDEA+locus.">Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus.</a> Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).</li><li>Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+Flexibility+of+Genomic+Imprinting+during+Seed+Development.">Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development.</a> Plant Cell. 23, 16-26 (2011).</li><li>Rea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+DNA+methylation+of+imprinted+genes+in+Arabidopsis+endosperm.">Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm.</a> J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).</li><li>Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+WOX+genes+mediates+apical-basal+axis+formation+in+the+Arabidopsis+embryo.">Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 14, 867-876 (2008).</li><li>Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana+MEDEA+Polycomb+group+protein+controls+expression+of+PHERES1+by+parental+imprinting.">The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting.</a> Nature. 37, 28-30 (2005).</li><li>Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate.">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).</li><li>Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+single+cells.">Transcriptome analysis of single cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).</li><li>Nodine, M. D., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+and+paternal+genomes+contribute+equally+to+the+transcriptome+of+early+plant+embryos.">Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos.</a> Nature. 482 (7383), (2012).</li><li>Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fusions:+beta-glucuronidase+as+a+sensitive+and+versatile+gene+fusion+marker+in+higher+plants.">fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.</a> EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).</li><li>Schmidt, A., W&#246;hrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+group+protein+MEDEA+and+the+DNA+methyltransferase+MET1+interact+in+Arabidopsis+to+repress+autonomous+endosperm+development.">The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development.</a> Plant J. 73 (5), (1111).</li></ol>

우리는 효과적인 급속 배아 분리 프로토콜을 개발, 쉽게 다른 실험실로 전송 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 장비는 거꾸로 현미경, 미세 조작기, 유리 microcapillaries, 수직 필라멘트 풀러와 microinjector (그림 3A)으로 구성되어 있습니다. 설치가 전사 체학 분석 17 한 동물 세포 분리에 대해 설명한 것과 비슷합니다. 우리는 또한 성공적으로 유리 microcapillaries?...

현화 식물의 배아는 배젖, 두 번째 수정 이벤트에서 파생 된 영양 조직으로 둘러싸여 있습니다. 모두 배아와 배유가 종피의 여러 세포 층에 의해 둘러싸여 있습니다. 종합적으로 이러한 조직은 과일 내부 개발 종자를 형성한다. 따라서, 조직 및 애기 장대 배아의 세포 별 분석은 강력하게 자신의 어려움으로 인해 손상됩니다. 그럼에도 불구하고, 늦은 구형 또는 이후 단계에서 배아는 비교적 잘 입체 현미경 하에서 미세 텅스텐 바늘을 사용하여 수동으로 해부 의무, 또는 그들을 추출하는 집게를 사용하여 초기에 약간의 압력을 적용하여 있습니다. 이러한 기술은 성공적으로 사체 또는 마이크로 어레이 하이브리드, 바이 설 파이트 시퀀싱, 또는 RNA 시퀀싱 (예 1-3)으로 epigenome 프로파일 분석에 사용 하였다. 반면, 초기 구상 단계에 수정란에서 배아의 연구는 기술적으로 도전 남아있다. 지금까지 몇 연구 담당자가고정 씨앗 섹션 4 좋은 도구 5를 사용하여 종자 내에서 개별 배아의 수동 추출에서 배아 조직 중 하나 레이저 캡처 microdissection을 (LCM)를 사용하여 젊은 배아 orted 사체 분석. 그러나 LCM 장비 초기 단계에서 일반적으로 사용되는 수동 배아 추출되지 않습니다 것은 시간이 쉽게 양도 할 수 없습니다 뛰어난 절개 기술을 소모하고 필요로하는 것입니다. 게놈 넓은 분석뿐만 아니라, 현장에서 유전자 발현 분석도 애기 장대의 젊은, 전체 마운트의 배아에서 수행하기가 어렵습니다. 어느 정도 젊은 배아는 씨앗 부드러운 압력에 의해 현미경 슬라이드에 해제 할 수 있습니다 (예를 들어 6,7 참조) 면역 염색하여 리포터 유전자 분석 또는 단백질 검출에 사용됩니다. 이 기술은, 그러나, 따라서 정량 분석​​을 방해, 높은 처리량 배아 분리를 허용하지 않습니다. 그러므로, 우리는 효율적이고 빠른 프로토콜을 개발쉽게 양도 및 다운 스트림 응용 프로그램의 다양한 적합한 설정이 간단하고 애기 장대 씨앗에서 초기 배아 분리합니다. 적절한 분리 버퍼에 플라스틱 유봉을 사용하여 에펜 도르프 튜브에 젊은 siliques에서 해부 - 기본 원칙은 부드럽게 씨앗을 분쇄하는 것입니다. 종자 추출물은 다 잘 슬라이드에 방울에 배치되어 거꾸로 현미경을 사용하여 원하는 단계에서 출시 된 배아의 존재 여부를 검사합니다. 배아는 유리 microinjector 또는 표준 실험실 피펫에 부착 microcapillary 사용하여 수집됩니다. 분자 응용 프로그램의 경우, 배아는 최소한의 볼륨에서 대상 버퍼로 전송하기 전에 새로운 절연 버퍼의 방울에 반복 릴리스 회 세척한다. 세포 학적 응용 프로그램 (기자 분석, 면역 염색, FISH)의 경우, 세척 단계는 생략 할 수 있습니다. 방법은 여러 가지 장점을 제공합니다 : (i)는 세포 학적 응용을위한 45 분 ~에 25-40 배아를 산출분자 응용 프로그램 (세척 단계 포함) lications 3-4 시간에서, (II) 그것은 특정 배아 단계의 분리는, (III)는 (IV), 쉽게 단순 설정에 따라 다른 사람과 실험실에 양도 할 수 있습니다 , 업그레이드에 대한 의무가 기본 설정을위한 저렴한 장비를 필요로하고, (v)이 성공적으로 RNA 염기 서열 8, 유전자의 특정 DNA 메틸화 분석 9, 기자 분석 (10 Raissig 등. 등 다양한 다운 스트림 응용 프로그램에 사용 된 의 준비.) 및 FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux되지 않은,)는 그림 5를 참조하십시오.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>SIGMA </td>
 <td>SL2-100 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse OUT</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>10777-019</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>First- strand buffer</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>18064-022</td>
 <td>contained in Superscript II package</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>18064-022</td>
 <td>contained in Superscript II package</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml </td>
 <td>New England Biolabs Inc.</td>
 <td></td>
 <td>Different suppliers will also work </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thin wall Capillaries 1.0 mm</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>TW100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNA LoBind tube 0.5 ml</td>
 <td>Vaudaux-Eppendorf</td>
 <td>0030108.035</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTrics&Delta; 30 &mu;m</td>
 <td>PARTEC</td>
 <td>04-0042-2316</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5wells 10 mm diameter slides</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>63421-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde Solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F1635</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost Plus slide</td>
 <td>Thermo Fisher</td>
 <td>J1800AMNZ</td>
 <td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris</td>
 <td>Amaresco</td>
 <td>0497</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Applichem</td>
 <td>A2937</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycin</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>50050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SDS pellets</td>
 <td>Roth</td>
 <td>CN30.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Pestle</td>
 <td>VWR</td>
 <td>431-0094</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microfine insulin syringes</td>
 <td>BD</td>
 <td>U-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D5758</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Schaurlau</td>
 <td>ET00102500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forceps N5</td>
 <td>Dumont</td>
 <td>0108-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bioanalyzer Pico Chip</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted microscope</td>
 <td>Nikon TMS (Japan),</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micromanipulator</td>
 <td>Leitz</td>
 <td></td>
 <td>Leica</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micomanipulator Post mount LH1 probe</td>
 <td>Leica microsystems</td>
 <td>39430101</td>
 <td>Different brand will also do the work</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vertical filament puller</td>
 <td>Sutter instrument</td>
 <td>P-20 model</td>
 <td>Other model are also suitable </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell Tram vario</td>
 <td>Vaudaux-Eppendorf</td>
 <td>5176.000.033</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>2100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qubit Fluorometer</td>
 <td>Invitrogen (life technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

efficient and rapid isolation of early-stage embryos from arabidopsis thaliana seeds

배유 - - 임산부 씨 integuments (또는 종피)에 의해 둘러싸여 현화 식물에서 배아 영양 조직 내에서 개발하고 있습니다. 결과적으로, 초기 단계 (구상 단계 1 셀)에서 식물의 배아의 분리가 기술적으로 상대적인 어려움으로 인해 도전합니다. 초기 단계에서 효율적인 수동 박리 강력 젊은 애기 씨의 작은 크기와 주변 조직에 배아의 부착에 의해 손상된다. 여기, 우리는 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 1 시간에서 4 시간 40 배아까지 항복, 젊은 애기 태아의 효율적인 분리를 허용하는 방법을 설명합니다. 배아는 약간 에펜 도르프 튜브에 플라스틱와 유 봉, 250-750 씨앗을 분쇄하여 분리 버퍼에 해제됩니다. 유리는 표준 실험실 피 펫 중 하나에 연결 microcapillary (고무 튜브를 통해) 또는 유압 제어 microinjector은 방울 곳에서 배아를 수집하는 데 사용됩니다거꾸로 광학 현미경에 다 잘 슬라이드 라. 필요한 전문 기술은 간단하고 쉽게 양도 할 수 있으며, 기본 설정 값 비싼 장비를 필요로하지 않습니다. 수집 된 배아는 RT-PCR, RNA 서열, DNA 메틸화 분석, 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광 면역 염색 및 리포터 유전자 분석과 같은 다운 스트림 응용 프로그램의 다양한 적합합니다.

세척이 분자 응용 프로그램에 대한 예를 들어, 수행하는 경우에 우리의 배아 분리 절차 (그림 1) 4 시간 40 배아까지의 분리를 허용하거나, 시간 미만의 세척은 생략 세포 학적 응용 프로그램의 예 경우. 그림 2는 표시 높고 낮은 품질 microcapillary 팁과 그림 3은 배아 분리 시스템의 설정을 보여줍니다. 그림 4는 거꾸로 현미경에서 배아 ?...

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Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

우리의 개발 초기 단계에서 배아를 분리하는 효율적이고 간단한 방법을보고<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗. 최대 40 배아 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 1 시간에서 4 시간으로 격리 할 수​​ 있습니다. 절차는 DNA 메틸화, 리포터 유전자 발현, 면역 염색 및 형광 사체에 적합합니다<em&gt; 현장에서</em&gt; 교잡 분석.

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

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