Name: isolation of native soil microorganisms with potential for breaking down biodegradable plastic mulch films used in agriculture
Uploaded: 2013-05-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Native Soil Microorganisms with Potential for Breaking Down Biodegradable Plastic Mulch Films Used in Agriculture at JoVE.com

Dr. Stephen Alderman, Dr. David Leaf e Erin Macri é reconhecido agradecimento por ajuda com microscopia. Esta pesquisa foi financiada através de uma doação da Iniciativa de Pesquisa NIFA Specialty Crops, USDA SCRI-SREP Grant Award No. 2009-02484. Briana Kinash, Kevin Kinloch, Megan Leonhard Joseph McCollum, Maria McSharry e Nicole Pálido prestou assistência técnica excelente e discussões atenciosas.

Este processo requer pelo menos vários meses para a incubação de filmes BDM no solo, e vários meses para bioensaios sequenciais, tanto em placas de ágar-ágar e livre, caldo definido quimicamente para avaliar a colonização e degradação. Os métodos individuais são listados pela ordem em que será realizada. 1. Incubação de Films BDM no solo Incorporar filmes BDM no solo em condições que imitam aqueles em que se espera para se degradar. Adquirir 400 g ...

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O procedimento aqui descrito representa uma técnica de primeira passagem para o isolamento de potenciais degradadores BDM partir do solo, e foi utilizado com sucesso o isolamento de fungos de BDMs enterrados no solo, durante sete meses. Fungos cresceram quando reinoculados em material de BDM fresco do mesmo tipo, que indica que os fungos isolados eram efectivamente colonizadores, e que as películas não foram inibidoras para o crescimento fúngico. Isolamento de fungos plástico de degradação e bactérias potencialm...

Degradação tem sido historicamente considerada um atributo indesejável de polímeros plásticos, porque quebra reduz a vida útil do produto e durabilidade. Recentemente, a consciência dos problemas ambientais apresentados por resíduos de plástico no meio ambiente natural 1,2,3 fez plásticos biodegradáveis ​​uma alternativa atraente para materiais plásticos convencionais. A degradação (definida como alterações estruturais, a fragmentação e redução do peso molecular, a integridade e força 4,5) ocorre através de uma série de eventos, incluindo ambos os processos abióticos (tensão térmica, foto-oxidação, a hidrólise, a erosão ea tensão mecânica), e degradação biológica 6. Enquanto os processos abióticos pode alterar o tamanho do fragmento e as características dos plásticos, os microorganismos são necessários para a sua mineralização final a água e dióxido de carbono (em condições aeróbicas) e / ou metano (sob condições anaeróbicas). Um nicho substancial paraplásticos biodegradáveis ​​existe na agricultura, onde coberturas de plástico são usados ​​para impedir o crescimento de ervas daninhas, para manter a humidade do solo e para aumentar a temperatura do solo 7,8. Centenas de milhares de hectares nos Estados Unidos só são cobertos com coberturas de plástico nove, incluindo coberturas compostas de plástico biodegradável. Após uma época de cultivo, as opções para a eliminação de coberturas biodegradáveis ​​(BDMs) incluir a eliminação em aterro, incineração para recuperação de energia 10, a degradação via compostagem, ou degradação no solo após o preparo 11. Destes, o destino menos trabalhoso é arar BDMs no solo, mas sem degradação eficiente e mineralização durante os meses de não-colheita (geralmente no inverno), fragmentos de plástico podem permanecer e interferir com equipamentos agrícolas durante o cultivo e plantio de primavera, e persistem no ambiente onde elas impactam significativamente fauna, flora e microbiota 1,2,3,10. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Apesar de muitos produtos de plástico, incluindo filmes de cobertura para solos agrícolas, de trazer o rótulo &quot;biodegradável&quot; ou &quot;compostável&quot;, na prática, a degradação e mineralização pode ser muito ineficiente e / ou muito incompleto para decomposição no solo a ser um alternativa viável para a eliminação destes produtos. Por exemplo, os polietilenos oxobiodegradáveis ​​conseguida apenas 12,4% mineralização após um ano de resistência e três meses subsequentes em 58 ° C do composto e menos do que metade dessa quantidade de mineralização ocorreu quando a temperatura do composto foi de 25 ° C 12. No inverno, a temperatura do solo na maioria dos locais seria menor do que qualquer uma dessas temperaturas, presumivelmente resultando em ainda menor atividade microbiana e, conseqüentemente, menor mineralização. Além de diminuir as taxas de degradação, mau uso do termo &quot;biodegradável&quot; levou a desconfiar destes produtos por parte dos consumidores 13,14, incluindo aqueles na indústria agrícola. A biodegradação é a conversãode polímeros para o dióxido de carbono (e / ou metano) e água 14 por microrganismos que ocorrem naturalmente 4. Portanto, a biodegradação deve ser medido quimicamente, a associação física dos microorganismos com um substrato não implica a degradação microbiana do material. Como parte de um esforço para examinar o uso sustentável dos BDMs na agricultura, este estudo centrou-se na descoberta de microrganismos nativos de solos agrícolas que colonizam e degradar BDMs comercialmente disponíveis. Métodos de ensaio normalizados foram publicados para medir quimicamente a composição de plásticos biodegradáveis ​​por meios abióticos e biológicos 15,16,17. No entanto, estes métodos não resolvem degradação de plásticos por espécies microbianas individuais ou fornecer métodos para o seu isolamento. A metodologia aqui se assemelha mais de perto os métodos padronizados para avaliar plásticos para a resistência à ruptura microbiana após a inoculação de amostras com os esporos dos fungos18,19. Quando as formulações são conhecidos de plásticos e uma fonte de matéria-prima está disponível, o plástico em pó pode ser suspensa em meio à base de agar e degradação determinadas pela visualização de zonas de compensação 13. Este método já foi utilizado anteriormente para identificar microorganismos que degradam polímeros, tais como o poliuretano 20, poli-(butileno succinato-co-adipato) 21, e poli (ácido láctico) 22. Um processo semelhante envolve a suspensão de plástico em pó puro em meio líquido, onde o plástico é a única fonte de carbono 20,23. Embora estes métodos possuem a vantagem de um sistema definido, mal eles imitam degradação in situ de BDMs. Em primeiro lugar, a área de superfície é distribuído de forma diferente, porque BDMs não são dispersos em pequenas partículas por toda a matriz do solo, mas sim, vendidos e usados ​​como filmes. Em segundo lugar, a composição química do BDMs é diferente a partir de polímeros puros. BDMs geralmente conter aditivos tais comoagentes de enchimento, plastificantes, e corantes, e estes aditivos poderão afectar o crescimento microbiano e, portanto, a taxa de mineralização. Por esta razão, e porque a composição de certos filmes comerciais neste estudo foram, película plástica, na sua forma proprietária campo pronta foi utilizada para o isolamento de fungos e bactérias. Para simplificar, os métodos abaixo descritos são apenas para os fungos, com as modificações observadas onde apropriado para isolamentos bacterianos. Em um estudo recente 24, três BDMs comercialmente disponíveis e um filme experimental foram usados ​​em locais agrícolas em três diferentes regiões dos Estados Unidos para um período de crescimento, e posteriormente colocadas em mesh (250 mícron) malas e enterrado por um inverno no solo nos mesmos locais. Os 250 mícron aberturas de malha permitir hifas fúngicas penetrar, excluindo a maioria das raízes e fauna do solo e minimizar a invasão do solo 25,26. Materiais de nylon saco de evitar a degradação do solo. Após escavação, fungal isolados foram recuperados a partir de pedaços BDM e avaliada para crescimento em meio mínimo, sem uma fonte de carbono, excepto para o agar e de 5 cm x 5 cm quadrados de superfície de película desinfestadas BDM novo, não utilizado, que foi pré-autoclavado. A maioria dos filmes plásticos usados ​​como não pode ser esterilizado, sem perda da integridade, assim luz UV foi utilizado para matar as células microbianas que residem nos plásticos. ISO 19 846 recomenda-desinsectização superfície em 70% de etanol e subsequente secagem, mas se utilizar este método, deve-se assegurar que nenhum componente ou aditivo da película é afectada negativamente pelo etanol. Desde BDMs presumivelmente são fabricados para suportar a luz solar, os raios UV foi escolhida como método de descontaminação. Os isolados que cresciam em pedaços BDM melhor do que em meio mínimo sozinho foram seleccionados para estudo posterior. Agar, um polissacárido produzido por algas marinhas, é utilizado para solidificar meios microbianos porque ele normalmente não é utilizado por metabolicamente agricolamente e não medicamentemicroorganismos capazes, no entanto, ágar-hidrolisantes enzimas têm sido isolados a partir de bactérias e bactérias marinhas 27 hidrolisável agar também foram isoladas a partir do solo 28. BDM polímeros e ágar É esperado que sejam substratos raras para enzimas secretadas pelos fungos do solo, o que não evoluíram em ambientes que contêm esses polímeros, como potenciais fontes de nutrientes, mas ambos os substratos estão presentes na placa de bioensaio aqui descritas (Passo 7). Fungos que utilizam BDMs agar, mas não como uma fonte de carbono pode ser diferenciado a partir de fungos, que utilizam apenas de ágar, por meio da comparação do crescimento em meio solidificado com ágar contendo i) sem adição de fonte de carbono, excepto ágar (controlo negativo), ii) filmes BDM (experimental) e iii) a glicose (controle positivo). O crescimento de todas as amostras é esperado em meio mínimo e glicose; fungos não proveniente de glicose contendo placas poderão não ser capazes de crescer em meio mínimo específico utilizado na experiência. Potengiai BDM degradadores deve crescer em agar solidificado meio mínimo + filme BDM melhor do que crescem em meio solidificado com ágar mínimo sozinho. Os fungos crescem em placas de meio mínimo de agar são-degradadoras ou oligotrophs, e também devem crescer no ágar relacionado com BDM filmes em placas de bioensaio, mas não nas próprias películas (a menos que por acaso também degradam polímeros BDM). Para eliminar a possibilidade de ver o crescimento microbiano devido à utilização de ágar e não da BDMs, seguimos o nosso ensaio inicial para a colonização BDM em placas de agar com um bioensaio em meio de caldo definida (Passo 9). BDM peças representada a fonte de carbono conhecida apenas nos tubos de bioensaios. Após a triagem inicial, e sobre reviver stocks glicerol dos isolados, alguns formados micélio escasso, mas visível em meio líquido definido contendo nenhuma fonte de carbono conhecido. Estes resultados sugerem que alguns dos isolados foram adquiridos oligotrophs - organismos que crescem por varrimento muito pequenas quantidades de carbono, azoto e outros nutrientes dissolvidos, quer em meio aquoso ou que existe como materiais voláteis no ar 29,30,31. Identificação das espécies através de análise de DNA ribossomal 18S apoiado este ponto de vista, como muitos dos isolados correspondentes gêneros de fungos relatado anteriormente para expor oligotrofia 32. Oligotrophs, que são vulgarmente saprófitas, requerem um amplo leque de capacidades metabólicas para a utilização do substrato numa gama de ambientes de 30. Assim, não é de estranhar que os mesmos fungos isolados de nós BDMs (presumivelmente exigindo capacidades enzimáticas incomuns) demonstraram capacidades oligotróficas, e foram capazes de crescer em traços de contaminantes, como óleos de pele de impressões digitais, poeira ou traço voláteis no ar. Devido ao isolamento de oligotrophs, concluiu-se que o crescimento sobre uma superfície BDM por si só não pode ser usada para inferir a ruptura de BDM. Os métodos descritos aqui refletem os nossos esforços para screen colonizadores BDM nativas de solos agrícolas para a quebra BDM bona fide.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Reagent Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potato Dextrose Agar</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>8X05491</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Agar</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP 1423-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Chloramphenicol</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>200-287-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Glutaraldehyde</td>
 <td>Electon Microscopy Sciences</td>
 <td>16216-10</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Molecular sieve</td>
 <td>Fisher </td>
 <td>M-8892</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Ethanol</td>
 <td>Pharmco-Aaper</td>
 <td>E200</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Contrex</td>
 <td>Decon Labs, Inc.</td>
 <td>5204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Parafilm M</td>
 <td>Pechiney Plastic Packaging</td>
 <td>S37440</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Mineral salts for buffers and media</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>Various</td>
 <td>Various vendors sell these reagents</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of native soil microorganisms with potential for breaking down biodegradable plastic mulch films used in agriculture

Fungos nativas em solos agrícolas que colonizaram mulch (BDM) filmes biodegradáveis ​​disponíveis comercialmente foram isolados e avaliados quanto ao potencial de degradar plástico. Normalmente, quando as formulações são conhecidos de plásticos e uma fonte de matéria-prima está disponível, o plástico em pó pode ser suspensa em meio à base de agar e degradação determinadas pela visualização de zonas de compensação. No entanto, esta abordagem pouco imita degradação in situ de BDMs. Primeiro, BDMs não são dispersas na forma de partículas pequenas em toda a matriz do solo. Em segundo lugar, BDMs não são vendidos comercialmente como polímeros puros, mas sim como filmes contendo aditivos (por exemplo agentes de enchimento, plastificantes e corantes) que podem afectar o crescimento microbiano. Os procedimentos aqui descritos foram usados ​​para os isolados obtidos a partir de filmes de cobertura do solo enterrado. Isolados fúngicos adquiridos de BDMs escavados foram testados individualmente para o crescimento em pedaços de novos BDMs desinfestadas estabelecidas sobre meio definido contendo nenhuma fonte de carbono eXCEPT ágar. Os isolados que cresciam em BDMs foram ainda testados em meio líquido onde BDMs foram a única fonte de carbono adicionado. Depois de aproximadamente 10 semanas, colonização e degradação BDM foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura. Isolados foram identificados através da análise de seqüências de genes de RNA ribossômico. Este relatório descreve métodos para isolamento de fungos, bactérias, mas também foram isolados utilizando esses métodos, substituindo os meios adequados para as bactérias. Nossa metodologia deve ser útil para os estudos que investigam quebra de filmes plásticos intactos ou produtos para os quais matérias-primas plásticas são desconhecidos ou não disponível. No entanto, nossa abordagem não fornece um método quantitativo para comparar as taxas de degradação da BDM.

Em um estudo recente 24, quatro repetições cada uma das três BDMs comercialmente disponíveis rotulados como &quot;biodegradáveis&quot;, além de um filme experimental e um controle de plástico convencional, foram colocadas sobre o solo como cobertura morta para a produção de tomate, na primavera de 2010, em Mount Vernon, WA, Knoxville, TN, e Lubbock, TX. No outono de 2010, quadrados BDM filme foram cortadas de cada resistido bagaço, em quatro parcelas de replicar, e do solo nativa removida imediatame...

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Isolation of Native Soil Microorganisms with Potential for Breaking Down Biodegradable Plastic Mulch Films Used in Agriculture

Filmes plásticos rotulados como &quot;biodegradável&quot; estão disponíveis comercialmente para uso agrícola como coberturas. Preparo representa um método de eliminação atraente, mas a degradação sob condições de campo é mal compreendida. O objetivo deste estudo foi desenvolver métodos para isolar fungos de solo nativo e bactérias que colonizam filmes mulch plástico após o enterro de campo.

Isolamento de microrganismos do solo nativas com potencial para romper as biodegradáveis ​​Palha filmes plásticos usados ​​na agricultura

Fungi native to agricultural soils that colonized commercially available biodegradable mulch (BDM) films were isolated and assessed for potential to ...

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