Name: transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal
Uploaded: 2013-08-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl at JoVE.com

Vi takker Sacha Reichman og Dominique Santiard-Baron for deres hjælp med at redigere RNA oprensningsprotokol.

1.. Journal: procedure til inddrivelse af prøver fra Kirurgisk Block I laboratoriet <ol><li> Få en indførsel kontrakt fra express rederi. </li><li> Fyld 10 (eller 25) skibsfart formularer med den postadresse laboratoriet angiver kontaktperson i laboratoriet (telefonnummer og e-mailadresse). </li><li> Forbered 10 (eller 25) prøver formularer nummereret fra 1 til 10 (eller 25). Disse former omfatter dedikerede rum til at informere om a) anonym identifikation af patienten, b) datoen for kiru...

<ol>
	<li>Mitry, D., Charteris, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+rhegmatogenous+retinal+detachment:+geographical+variation+and+clinical+associations.">The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations.</a> The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).</li><li>Green, R. E., Krause, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+sequence+of+the+Neandertal+genome.">A draft sequence of the Neandertal genome.</a> Science. 328 (5979), 710 (2010).</li><li>Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleic+acid+isolated+by+cesium+chloride+centrifugation.">Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation.</a> Biochemistry. 13 (12), 2633 (1974).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).</li><li>Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coli+tRNAs+as+inhibitors+of+viral+reverse+transcription+in+vitro.">coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).</li><li>Sawadogo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+inhibition+of+yeast+RNA+polymerases+A+and+B+by+tRNA+and+alpha-amanitin.">On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin.</a> Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).</li><li>Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+detachment+reveals+both+inflammatory+response+and+photoreceptor+death.">Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death.</a> PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).</li><li>Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RETINOBASE:+a+web+database,+data+mining+and+analysis+platform+for+gene+expression+data+on+retina.">RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina.</a> BMC Genomics. 9, 208 (2008).</li><li>Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+chemoattractant+protein+1+mediates+retinal+detachment-induced+photoreceptor+apoptosis.">Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).</li><li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases:+from+clinic+to+redox+signaling.">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).</li><li>Chalmel, F., Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).</li></ol>

Udviklingen af ​​en procedure for væv opsving fra den kirurgiske blok har været afgørende for den transkriptomet analyse af nethindeløsning. Man bør bemærke, at denne type kirurgi praktiseres i en nødsituation, og at øjenlæger opererer har lidt tid til at deltage i et biologisk forskningsprogram, når de opererer. Denne retinectomy er også udført stokastisk i hver tjeneste, således at den nemmere måde at nå statistiske tal er at arbejde med et netværk. I dette netværk, er standardiseringen af ​​v...

Det vigtigste terapeutiske mål i nethindeløsning (RD) er at finde en måde at begrænse fotoreceptor celleskader og retinal inflammation som følge af adskillelsen af ​​fotoreceptorer fra retinale pigmenterede epitelceller. Under RD, er RPE celler aktiveres, migrere, dedifferentiate og formere ved overfladen af ​​den fritliggende nethinden, udøve kontraktile kræfter fører til komplikationer. Transcriptomics analyse af RD er en måde at identificere target gener med ændret udtryk efter RD og dermed de fremtidige terapeutiske molekyler, der kunne forbedre den endelige visuelle resultat i kombination med kirurgi. Det er velkendt ribonucleinsyre (RNA) er ikke stabil som er deoxyribonukleinsyre (DNA), sidstnævnte bliver brugt i vid udstrækning til genetiske undersøgelser, havde dens stabilitet tilladt sekventering af Neanderthal genom fra palæontologiske prøver af mere end 30.000 år gammel 2.. Transkription af DNA af generne fra genomet i messenger-RNA erstørre proces genekspression og mRNA er labil for at udgøre et signal. RNA&#39;er er meget hurtigt nedbrudt af RNAse enzymer, der udtræden signalet. Når væv er isoleret fra en organisme, de RNA er meget ofte nedbrydes, før udtrykket er undersøgt i et forskningslaboratorium. Uregelmæssig RNA er ikke egnet til analyse genekspression. Fordi laboratoriet personale ikke kan deltage i kirurgi, vi udviklet en procedure, der er let og kræver kun, at kirurgen til at inddrive væv i en passende RNAse-fri opløsning. RNA fra vævene er stabil og kan analyseres uden nogen tegn på nedbrydning efter 72 timer ved stuetemperatur i denne opløsning. RNA&#39;erne fra prøver oprenses ved en standardiseret fremgangsmåde der involverer en ultracentrifugering på en cæsiumchloridgradient efter at være blevet overført til laboratoriet 3.. Derefter er kvaliteten af ​​RNA&#39;erne vurderes ved agarosegelelektroforese og med RT-PCR. RNA oprensningsprotokol harfordel at adskille molekylerne i henhold til deres densitet, der er forskellig for DNA og RNA, og sikrer, at RNA ikke er forurenet med et DNA-molekyler, der vil generere kunstig signaler i genekspressionsstudier. Desuden er de transfer RNA&#39;er (tRNA&#39;er), som er kvantitativt mest rigelige RNA inden for en celle, adskilles efter samme fysiske egenskab fra det ribosomale RNA (rRNA), og messenger RNA (mRNA), de to sidste er de slutprodukt af rensningsprocessen. Fjernelsen af tRNA fra præparatet er nyttigt, da de fleste af microarray analysemetoderne indebar brug af reverse transkriptase og RNA polymeraser, der inhiberes af tRNA 4-6. De rensede RNA fra kirurgiske prøver er mærket ved hjælp af standard protokol og hybridiseret til en microarray chip, og resultaterne analyseres ved hjælp af to komplementære metoder, den falske opdagelse sats metode, og ved hjælp af en ny metode baseret på gensidig information og visualiseringzed på webbaserede server Retinobase 7,8.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Aventi J-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JS-5.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>LE 80K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>SW41</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Power supply</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>Pac 3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PolytronTM</td>
 <td>Kinematica</td>
 <td>PT 2100</td>
 <td>Supplied with PT-DA 2105:2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose gel electrophoresis device</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>MiniGel Cell GT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imaging System </td>
 <td>Biorad</td>
 <td>GelDoc-It Imager</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml sterile polyethylene tube</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>115261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile polyallomer centrifuge tube </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>331372</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemical reagents</td>
 <td>Sigma</td>
 <td></td>
 <td>Molecular biology grade (RNase and DNase free products)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cleaning Solution </td>
 <td>VWR </td>
 <td>RBS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microarray chip</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>Human U133 plus 2 array</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal

Nethindeløsning (RD) beskriver en adskillelse af den neurosensoriske nethinde fra den retinale pigmenterede epithelium (RPE). RPE er afgørende for en normal funktion af de lysfølsomme neuroner, de fotoreceptorer. Nethindeløsning fra RPE skaber en fysisk hul, der er fyldt med ekstracellulære væske. RD indleder cellulære og molekylære hændelser, der påvirker både neurosensoriske nethinden og RPE siden fysiologiske udveksling af ioner og metabolitter er alvorligt foruroliget. Konsekvensen for vision er relateret til varigheden af løsrivelse da en hurtig reapposition af de to væv resulterer i genoprettelsen af synet 1.. Behandlingen af ​​RD er udelukkende kirurgisk. Fjernelse af glasagtige gel (vitrektomi) efterfølges af fjernelse ikke væsentlig del af nethinden omkring den fritliggende område at favorisere nethindeløsning. De fjernede retinale eksemplarer er res nullius (intet) og dermed normalt kasseres.At inddrive RNA fra disse kirurgiske prøver vi udviklet procedure tidsskrift, der tillader RNA bevaring under overførslen fra den kirurgiske blok til laboratoriet. Vi har også standardiseret en protokol til oprensning af RNA ved cæsiumchlorid-ultracentrifugering at sikre, at de oprensede RNA&#39;er er egnede til globale genekspression analyse. Kvaliteten af ​​RNA blev valideret både ved RT-PCR og microarray analyse. Analyse af data viser en simultan inddragelse af inflammation og fotoreceptordegenerering løbet RD.

Proceduren Journal (figur 1) giver os inddrive eksemplarer af nethinden fra den kirurgiske blok til oprenset RNA og analysere transkriptomet af nethindeløsning. Nethindeløsning resulterer i opregulering af monocytkemotaktisk MCP1 gen CCL2, og faldet i ekspressionen af stangen fotoreceptor transducerende gen GNAT1, kortbølge kegle opsin OPN1SW og homeogene CRX (figur 2). Induktionen af CCL2 er resultatet af betændelse 9, mens de...

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl at JoVE.com

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Vi brugte retina prøver fra retinectomy for en transkriptom analyse af nethindeløsning. Vi udviklede en procedure, der gør det muligt for RNA bevaring mellem de kirurgiske blokke og laboratoriet. Vi standardiseret en protokol til oprensning af RNA ved cæsiumchlorid-ultracentrifugering at sikre, at de oprensede RNA&#39;er er egnet til microarray analyse.

Transkriptom analyse af menneskets retinale kirurgiske prøver vha. Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Forbedret protokol for Laser mikrodissektion Of Menneskelige pancreasøer fra kirurgiske Prøver

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

To metoder til fastsættelse primære humane Endometriecancer stromacellers fra Hysterektomi Prøver

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

En trin for trin Protokol for subretinal kirurgi i kaniner

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Generering af en humaniseret Mouse Lever Brug humane lever Stamceller

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Intravital mikroskopi af Tumor-associerede Vaskulaturen ved hjælp af avancerede dorsale Skinfold vindue kamre på transgene fluorescerende mus

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Ved hjælp af In Vitro Live-celle Imaging for at udforske kemoterapeutika leveret af Lipid-baserede nanopartikler

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Surgical Training for the Implantation of Neocortical Microelectrode Arrays Using a Formaldehyde-fixed Human Cadaver Model

Kirurgiske uddannelse til Implantation af Neocortical mikroelektrode Arrays ved brug af en formaldehyd-fast menneskelige Kadaver Model

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Diagnose og kirurgisk behandling af human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induktion og analyse af oxidativ stress i tornerose Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epitelceller

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...