Name: transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal
Uploaded: 2013-08-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl at JoVE.com

Wir danken Sacha Reichmann und Dominique Santiard-Baron für ihre Hilfe bei der Bearbeitung der RNA Aufreinigung Protokoll.

1. JOURNAL: Verfahren, um die Proben aus der OP-Block Recover Im Labor <ol><li> Holen Sie sich einen Vertrag Einfuhr von Eilschiffahrtsgesellschaft. </li><li> Füllen 10 (oder 25) bildet mit dem Versand Postanschrift des Labors, die die Ansprechpartner im Labor (Telefonnummer und E-Mail-Adresse). </li><li> Planen 10 (oder 25) Proben Formen nummeriert von 1 bis 10 (oder 25). Diese Formen sind dedizierte Bereiche auf einer) anonyme Identifikation des Patienten informieren, b) das Datum der Oper...

<ol>
	<li>Mitry, D., Charteris, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+rhegmatogenous+retinal+detachment:+geographical+variation+and+clinical+associations.">The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations.</a> The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).</li><li>Green, R. E., Krause, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+sequence+of+the+Neandertal+genome.">A draft sequence of the Neandertal genome.</a> Science. 328 (5979), 710 (2010).</li><li>Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleic+acid+isolated+by+cesium+chloride+centrifugation.">Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation.</a> Biochemistry. 13 (12), 2633 (1974).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).</li><li>Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coli+tRNAs+as+inhibitors+of+viral+reverse+transcription+in+vitro.">coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).</li><li>Sawadogo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+inhibition+of+yeast+RNA+polymerases+A+and+B+by+tRNA+and+alpha-amanitin.">On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin.</a> Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).</li><li>Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+detachment+reveals+both+inflammatory+response+and+photoreceptor+death.">Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death.</a> PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).</li><li>Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RETINOBASE:+a+web+database,+data+mining+and+analysis+platform+for+gene+expression+data+on+retina.">RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina.</a> BMC Genomics. 9, 208 (2008).</li><li>Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+chemoattractant+protein+1+mediates+retinal+detachment-induced+photoreceptor+apoptosis.">Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).</li><li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases:+from+clinic+to+redox+signaling.">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).</li><li>Chalmel, F., Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).</li></ol>

Die Entwicklung eines Verfahrens zur Gewebe Erholung von der OP-Block ist wesentlich für die Transkriptom-Analyse der Netzhautablösung. Man sollte beachten, dass diese Art der Operation in Not und die Augenärzte Betriebssystem haben wenig Zeit, um in einer biologischen Forschungsprogramm teilnehmen, wenn sie tätig wird geübt. Diese Retinektomie auch stochastisch in jeden Dienst durchgeführt, so dass der einfachere Weg zu statistischen Zahlen erreichen, mit einem Netzwerk zu arbeiten. In einem solchen Netzwerk ist ...

Die wichtigste therapeutische Ziel in Netzhautablösung (RD) ist, einen Weg zu Photorezeptor Zellschäden und Netzhautentzündungen aus der Abtrennung von den Photorezeptoren der retinalen pigmentierten Epithelzellen begrenzen finden. Während RD, sind RPE-Zellen aktiviert, wandern, dedifferenzieren, und vermehren sich an der Oberfläche der abgelösten Netzhaut ausübt kontraktilen Kräfte führt zu Komplikationen. Transcriptomics Analyse der RD ist ein Weg, um Zielgene mit modifizierten Ausdruck identifizieren nach RD und damit zukünftige therapeutische Moleküle, die endgültige visuelle Ergebnis in Kombination mit Chirurgie verbessern könnte. Es ist bekannt, Ribonukleinsäure (RNA) ist nicht stabil wie Desoxyribonukleinsäure (DNA), wobei letztere ausgiebig für genetische Studien verwendet wird, hatte seine Stabilität die Sequenzierung des Neandertaler-Genoms von paläontologischen Proben von mehr als 30.000 Jahre alt 2 zulässig. Die Transkription der DNA der Gene aus dem Genom in Boten-RNA istHauptprozess in der Genexpression und der mRNA ist, um ein Signal zu bilden labil. RNAs sind sehr schnell durch RNAse Enzyme, die das Signal zu beenden. Wenn Gewebe aus einem Organismus isoliert werden, sind die RNAs sehr oft abgebaut, bevor der Ausdruck in einem Forschungslabor untersucht wird. Gestörter RNA ist nicht für die Analyse der Genexpression geeignet. Da das Laborpersonal nicht in der Chirurgie zu beteiligen, wurde ein Verfahren entwickelt, das einfach und erfordert lediglich, dass der Chirurg das Gewebe in eine geeignete RNAse-freie Lösung zu erholen. Die RNA aus den Geweben ist stabil und kann ohne Anzeichen von Abbau nach 72 Stunden bei Raumtemperatur in dieser Lösung analysiert werden. Die RNAs von Proben werden durch ein standardisiertes Verfahren, das eine Ultrazentrifugation auf einem Cäsiumchloridgradienten nachdem das Labor 3 übertragen wurden gereinigt. Dann werden die Qualität der RNA durch Agarose-Gelelektrophorese und mittels RT-PCR untersucht. Die RNA Aufreinigung Protokoll hat dieVorteil der Trennung der Moleküle nach ihrer Dichte, die sich für die DNA und RNA ist und gewährleistet, dass die RNA nicht durch eine DNA-Moleküle, die Artefakt-Signale in Genexpressionsstudien erzeugen verunreinigt. Darüber hinaus werden die Transfer-RNAs (tRNAs), die quantitativ sind die häufigsten RNA in einer Zelle gemäß der gleichen physikalischen Eigenschaft aus der ribosomalen RNA (rRNA) und die Messenger-RNA (mRNA), die beiden zuletzt die das abgetrennte Endprodukt des Reinigungsprozesses. Die Entfernung der tRNA aus der Herstellung ist nützlich, da die meisten der Mikroarray Analyseprotokollen bei dem durch Verwendung von Reverse Transkriptase und RNA-Polymerasen, die von tRNA 4-6 gehemmt werden. Die gereinigte RNA von chirurgischen Proben markiert sind unter Verwendung des Standardprotokolls und hybridisiert mit einem Microarray-Chip und die Ergebnisse wurden mit zwei komplementären Verfahren der False Discovery-Verfahren und unter Verwendung eines neuartigen Verfahrens zur gegenseitigen Information und Visualisierung basierendzed auf der web-basierten Server Retinobase 7,8.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Aventi J-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JS-5.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>LE 80K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>SW41</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Power supply</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>Pac 3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PolytronTM</td>
 <td>Kinematica</td>
 <td>PT 2100</td>
 <td>Supplied with PT-DA 2105:2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose gel electrophoresis device</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>MiniGel Cell GT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imaging System </td>
 <td>Biorad</td>
 <td>GelDoc-It Imager</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml sterile polyethylene tube</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>115261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile polyallomer centrifuge tube </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>331372</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemical reagents</td>
 <td>Sigma</td>
 <td></td>
 <td>Molecular biology grade (RNase and DNase free products)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cleaning Solution </td>
 <td>VWR </td>
 <td>RBS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microarray chip</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>Human U133 plus 2 array</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal

Netzhautablösung (RD) beschreibt eine Trennung der Neuroretina aus dem retinalen Pigmentepithel (RPE). Das RPE ist wichtig für die normale Funktion der lichtempfindlichen Nervenzellen, die Photorezeptoren. Ablösung der Netzhaut von der RPE schafft eine physische Lücke, die mit extrazellulären Flüssigkeit gefüllt ist. RD initiiert zellulären und molekularen unerwünschten Ereignisse, die sowohl die Neuroretina und die RPE da die physiologischen Austausch von Ionen und Metaboliten stark gestört wird beeinflussen. Die Folge für das Sehen ist auf die Dauer der Abteilung seit einer schnellen reapposition der beiden Geweben führt zur Wiederherstellung des Sehens 1 verbunden. Die Behandlung von RD ist ausschließlich chirurgisch. Entfernen des Glaskörpers (Vitrektomie) wird durch die Entfernung nicht wesentlicher Teil der Netzhaut um die freistehende Fläche zu Netzhautablösung begünstigen gefolgt. Die entnommenen Proben sind retinale res nullius (nichts) und damit in der Regel verworfen.Um RNA aus diesen chirurgischen Proben zu erholen, haben wir das Verfahren Journal, dass RNA Erhaltung ermöglicht während der Übertragung aus dem OP-Block an das Labor. Wir haben auch ein Protokoll zur standardisierten RNA durch Caesiumchlorid Ultrazentrifugation zu reinigen, um sicherzustellen, dass die gereinigten RNAs geeignet für globale Genexpressionsanalyse sind. Die Qualität der RNA wurde sowohl durch RT-PCR und Microarray-Analyse bestätigt. Die Analyse der Daten zeigt eine gleichzeitige Einbeziehung der Entzündung und Photorezeptordegeneration während RD.

Das Verfahren Journal (Abbildung 1) ermöglicht es uns erholen Exemplare der Netzhaut von der chirurgischen Block gereinigte RNA, und das Transkriptom der Netzhautablösung zu analysieren. Netzhautablösung führt zur Hochregulation des Monozyten chemotaktische MCP1 Gen CCL2, und in der Abnahme der Expression der Stange Photorezeptor Transduzieren Gen GNAT1, die Kurzwelle Kegel Opsin OPN1SW und die homeogene CRX (Abbildung 2). Die Induktion von Entzü...

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Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Wir verwendeten Retina Proben aus Retinektomie für eine Transkriptom-Analyse der Netzhautablösung. Wir entwickelten ein Verfahren, das RNA Konservierung zwischen den chirurgischen Blöcke und Labor ermöglicht. Wir standardisierten ein Protokoll zur RNA durch Caesiumchlorid Ultrazentrifugation, um sicherzustellen, dass die gereinigten RNAs geeignet für Microarray-Analyse sind zu reinigen.

Transkriptom-Analyse der menschlichen Retina chirurgischen Proben mit Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Verfahren zur Novel Anti-Cancer Drug Development mit Tumor Explantate von chirurgischen Proben


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Forschung

Medizin

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Verbessertes Protokoll für Laser Mikrodissektion Of Human Pankreasinseln Von chirurgischen Proben

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Zwei Methoden zur Festlegung von primären humanen Endometrium Stromazellen aus Hysterektomie Proben

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Eine Schritt für Schritt-Protokoll für Subretinale Chirurgie in Kaninchen

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Erzeugung eines humanisierten Maus-Leber unter Einsatz von menschlichem Leberstammzellen

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Intravitalen Mikroskopie von Tumor-assoziierten Gefäßsystem mit erweiterten dorsalen Hautfalte Fenster Kammern an transgenen Mäusen fluoreszierende

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Verwendung von In-vitro- Live Cell Imaging zur Erkundung Chemotherapeutika geliefert durch Lipid-basierte Nanopartikel

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Surgical Training for the Implantation of Neocortical Microelectrode Arrays Using a Formaldehyde-fixed Human Cadaver Model

Chirurgische Ausbildung für die Implantation der neokortikalen Mikroelektrode Arrays mit einem Formaldehyd-feste menschliche Kadaver-Modell

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Diagnose und chirurgische Behandlung von Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induktion und Analyse von oxidativem Stress in Dornröschen-Transposon-transfizierten menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...