Name: transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal
Uploaded: 2013-08-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl at JoVE.com

אנו מודים סשה רייכמן ודומיניק Santiard-רון על עזרתם בעריכת פרוטוקול טיהור רנ&quot;א.

1. כתב עת: נוהל לשחזר את הדגימות מהבלוק כירורגי במעבדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל חוזה יבוא מחברת ספנות מפורשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא 10 (או 25) צורות משלוח עם כתובת הדואר של המעבדה מצביעה על איש הקשר...

<ol>
	<li>Mitry, D., Charteris, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+rhegmatogenous+retinal+detachment:+geographical+variation+and+clinical+associations.">The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations.</a> The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).</li><li>Green, R. E., Krause, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+sequence+of+the+Neandertal+genome.">A draft sequence of the Neandertal genome.</a> Science. 328 (5979), 710 (2010).</li><li>Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleic+acid+isolated+by+cesium+chloride+centrifugation.">Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation.</a> Biochemistry. 13 (12), 2633 (1974).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).</li><li>Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coli+tRNAs+as+inhibitors+of+viral+reverse+transcription+in+vitro.">coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).</li><li>Sawadogo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+inhibition+of+yeast+RNA+polymerases+A+and+B+by+tRNA+and+alpha-amanitin.">On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin.</a> Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).</li><li>Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+detachment+reveals+both+inflammatory+response+and+photoreceptor+death.">Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death.</a> PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).</li><li>Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RETINOBASE:+a+web+database,+data+mining+and+analysis+platform+for+gene+expression+data+on+retina.">RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina.</a> BMC Genomics. 9, 208 (2008).</li><li>Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+chemoattractant+protein+1+mediates+retinal+detachment-induced+photoreceptor+apoptosis.">Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).</li><li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases:+from+clinic+to+redox+signaling.">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).</li><li>Chalmel, F., Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).</li></ol>

הפיתוח של הליך להתאוששות רקמה מהגוש כירורגית כבר חיוני לניתוח transcriptome של היפרדות רשתית. אחד צריך לשים לב כי סוג זה של ניתוח הוא התאמן בחירום ושיש לי ההפעלה רופאי העיניים קצת זמן כדי להשתתף בתכנית מחקר ביולוגית כאשר הם פועלים. retinectomy זה מבוצע גם stochastically בכל שירות, כך שה?...

המטרה הטיפולית העיקרית בהיפרדות רשתית (RD) היא למצוא דרך להגביל את נזק photoreceptor תא ודלקת רשתית כתוצאה מההפרדה של קולטניים אור מתאי אפיתל הפיגמנט ברשתית. במהלך RD, תאי הרשתית מופעלים, להעביר, dedifferentiate, ומתרבים על פני השטח של הרשתית המנותקת, הפעלת כוחות התכווצות שהובילו לסיבוכים. ניתוח transcriptomics של RD הוא דרך לזהות גני המטרה עם ביטוי שונה בעקבות RD ומולקולות טיפוליות עתידיות ומכאן שיכולים לשפר את התוצאה סופית חזותית בשילוב עם ניתוח. העובדה ידועה הוא חומצה ריבונוקלאית (RNA) אינה יציבה כפי שהיא חומצת deoxyribonucleic (DNA), האחרון בשימוש נרחב למחקרים גנטיים, יציבותו התירה הרצף של הגנום הניאנדרטלי מדגימות כפליאונטולוג של יותר מ -30,000 שנים 2. תמלול של ה-DNA של גנים מהגנום לתוך RNA השליח הואתהליך מרכזי בביטוי גנים, ואת ה-mRNA הוא יציב כדי להוות אות. RNAs מאוד במהירות מושפל על ידי RNAse אנזימים אשר לסיים את האות. כאשר רקמות מבודדות מהאורגניזם, את RNAs הם לעתים קרובות מאוד מושפל לפני הביטוי הוא למד במעבדת מחקר. RNA מושפל אינו מתאים לניתוח ביטוי גנים. כי צוות המעבדה לא יכול להשתתף בניתוח, פיתחנו הליך שהוא קל ורק דורש שהמנתח לשחזר את הרקמות לפתרון ללא RNAse מתאים. את הרנ&quot;א של הרקמות הוא יציב וניתן לנתח ללא כל סימן של הידרדרות לאחר 72 שעות בטמפרטורת חדר בפתרון זה. את RNAs מדגימות הם מטוהרים על ידי שיטה סטנדרטית מעורבת ultracentrifugation בשיפוע צזיום כלוריד, לאחר שהועבר למעבדה 3. ואז, איכות של RNAs מוערכות על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose ועל ידי RT-PCR. יש פרוטוקול טיהור RNAיתרון של הפרדת המולקולות על פי הצפיפות שלהם שהיא שונה עבור DNA ו-RNA ומבטיח כי רנ&quot;א אינו מזוהם על ידי מולקולות הדנ&quot;א שתפקנה אותות artifactual במחקרי ביטוי גנים. בנוסף, העברת RNAs (tRNAs), שהן כמותית את הרנ&quot;א הנפוץ ביותר בתוך תא, מופרדים על פי אותו הנכס הפיזי מרנ&quot;א ריבוזומלי (rRNAs) ואת RNAs השליח (mRNAs), שני אלה שעבר אחד להיות בסופו של תוצר הלוואי של תהליך הטיהור. הסרת tRNA מההכנה היא שימושית שכן רוב פרוטוקולי אנליטיות microarray כללו שימוש בtranscriptases בחסר וpolymerases RNA אשר מעוכבים על ידי tRNA 4-6. את הרנ&quot;א מנוקה מדגימות כירורגית מסומנים באמצעות פרוטוקול סטנדרטי והכלאה לשבב microarray והתוצאות מנותחות באמצעות שתי שיטות משלימות, שיטת שיעור הגילוי הכוזבת, ושימוש בשיטה חדשה המבוססת על מידע הדדי וvisualized בשרת מבוסס אינטרנט Retinobase 7,8.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Aventi J-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JS-5.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>LE 80K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>SW41</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Power supply</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>Pac 3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PolytronTM</td>
 <td>Kinematica</td>
 <td>PT 2100</td>
 <td>Supplied with PT-DA 2105:2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose gel electrophoresis device</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>MiniGel Cell GT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imaging System </td>
 <td>Biorad</td>
 <td>GelDoc-It Imager</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml sterile polyethylene tube</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>115261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile polyallomer centrifuge tube </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>331372</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemical reagents</td>
 <td>Sigma</td>
 <td></td>
 <td>Molecular biology grade (RNase and DNase free products)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cleaning Solution </td>
 <td>VWR </td>
 <td>RBS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microarray chip</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>Human U133 plus 2 array</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal

היפרדות רשתית (RD) מתארת ​​הפרדה של רשתית נוירו מאפיתל הפיגמנט ברשתית (הרשתית). הרשתית היא חיונית לתפקוד תקין של התאים העצב הרגישים לאור, photoreceptors. ניתוק של הרשתית מהרשתית יוצר פער פיזי, כי הוא מלא בנוזל חוץ תאי. RD יוזם תופעות לוואי תאיות ומולקולרית המשפיעות גם נוירו הרשתית והרשתית מאז חילופי פיסיולוגי של יונים ומטבוליטים הוא מוטרדים קשה. התוצאה עבור חזון קשורה לתקופת הניתוק מאז reapposition מהיר של תוצאות שתי הרקמות בשיקום הראייה 1. הטיפול בRD הוא אך ורק ניתוחי. הסרת ג&#39;ל זגוגית (Vitrectomy) ואחריו הסרת חלק החיוני שאינו של הרשתית באזור המרוחק לטובת היפרדות רשתית. דגימות רשתית הסיר הם מיל nullius (שום דבר) וכתוצאה מכך בדרך כלל מושלך.כדי לשחזר RNA מן הדגימות כירורגית אלה, פיתחנו את כתב עת ההליך המאפשר לרנ&quot;א שימור במהלך ההעברה מהבלוק כירורגית למעבדה. אנחנו גם טופל פרוטוקול לטהר הרנ&quot;א על ​​ידי ultracentrifugation צזיום כלוריד כדי להבטיח שRNAs המטוהר מתאים לניתוח ביטוי גנים הגלובלי. האיכות של RNA קבלה תוקף גם על ידי RT-PCR וניתוח microarray. ניתוח של הנתונים מראה מעורבות בו זמנית של דלקת וניוון photoreceptor במהלך RD.

הליך ז&#39;ורנל (איור 1) מאפשר לנו לשחזר את הדגימות של רשתית מהגוש כירורגית למטוהרי RNA, ולנתח את transcriptome של היפרדות רשתית. תוצאות היפרדות רשתית בupregulation של chemotactic גן מונוציטים MCP1 CCL2, ובירידה בביטוי של מוט photoreceptor transducing הגן GNAT1, קצר הגל החרוט Opsin OPN1SW, וCRX</e...

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl at JoVE.com

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

אנחנו השתמשנו בדגימות מרשתית retinectomy לניתוח transcriptomic של היפרדות רשתית. אנחנו פיתחה הליך המאפשר שימור RNA בין גושי הניתוח והמעבדה. אנחנו טופל בפרוטוקול כדי לטהר הרנ&quot;א על ​​ידי ultracentrifugation צזיום כלוריד כדי להבטיח שRNAs המטוהר מתאים לניתוח microarray.

ניתוח של דגימות כירורגית transcriptomic רשתית אדם שימוש Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

שיטה לפיתוח נגד סרטן רומן והתרופות באמצעות Explants גידול של דגימות כירורגי


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

שתי שיטות לקביעת אדם תאי רירית הרחם סטרומה ראשיים מדוגמאות כריתת הרחם

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

צעד אחר פרוטוקול שלב לכירורגיה subretinal בארנבונים

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

דור של כבד עכבר אנושי באמצעות תאי גזע אנושי כבדיה

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

מיקרוסקופ intravital להערכת סרטניים הקשורים לשימוש מתקדם הגבי צ'יימברס Skinfold חלון על העכברים הטרנסגניים פלורסנט

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

שימוש במבחנה לחיות תאים הדמיה כדי לחקור Chemotherapeutics מועברת על ידי חלקיקים המבוססת על שומנים בדם

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Surgical Training for the Implantation of Neocortical Microelectrode Arrays Using a Formaldehyde-fixed Human Cadaver Model

אימוני ניתוח ההשתלה של מערכים Neocortical Microelectrode באמצעות מודל של פורמלדהיד-קבוע גווייה אנושי

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

אבחון וטיפול כירורגי של דלקת ברוסלאר Spondylodiscitis אנושי

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

אינדוקציה וניתוח של עקה חמצונית ב היפהפייה הנרדמת טרנספוסון-transposon-transfected תאי אפיתל פיגמנט רשתית אנושית

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...