Name: transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal
Uploaded: 2013-08-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl at JoVE.com

Vi takker Sacha Reichman og Dominique Santiard-Baron for deres hjelp i å redigere RNA rensing protokollen.

En. Tidsskrift: Prosedyre for å gjenopprette de Prøvene fra Surgical Block I laboratoriet <ol><li> Få en innførsel kontrakt fra ekspress rederiet. </li><li> Fyll 10 (eller 25) frakt former med postadresse i laboratoriet viser kontaktperson i laboratoriet (telefonnummer og e-postadresse). </li><li> Forbered 10 (eller 25) samples formene nummerert fra 1 til 10 (eller 25). Disse skjemaene inkluderer dedikerte områder for å informere om a) anonym identifikasjon av pasienten, b) dato for ope...

<ol>
	<li>Mitry, D., Charteris, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+rhegmatogenous+retinal+detachment:+geographical+variation+and+clinical+associations.">The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations.</a> The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).</li><li>Green, R. E., Krause, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+sequence+of+the+Neandertal+genome.">A draft sequence of the Neandertal genome.</a> Science. 328 (5979), 710 (2010).</li><li>Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleic+acid+isolated+by+cesium+chloride+centrifugation.">Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation.</a> Biochemistry. 13 (12), 2633 (1974).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).</li><li>Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coli+tRNAs+as+inhibitors+of+viral+reverse+transcription+in+vitro.">coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).</li><li>Sawadogo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+inhibition+of+yeast+RNA+polymerases+A+and+B+by+tRNA+and+alpha-amanitin.">On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin.</a> Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).</li><li>Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+detachment+reveals+both+inflammatory+response+and+photoreceptor+death.">Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death.</a> PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).</li><li>Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RETINOBASE:+a+web+database,+data+mining+and+analysis+platform+for+gene+expression+data+on+retina.">RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina.</a> BMC Genomics. 9, 208 (2008).</li><li>Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+chemoattractant+protein+1+mediates+retinal+detachment-induced+photoreceptor+apoptosis.">Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).</li><li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases:+from+clinic+to+redox+signaling.">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).</li><li>Chalmel, F., Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).</li></ol>

Utviklingen av en prosedyre for utvinning vev fra det kirurgiske blokken har vært avgjørende for transkriptomet analyse av netthinneavløsning. Man bør legge merke til at denne type kirurgi er praktisert i krise og at øyeleger opererer har liten tid til å delta i et biologisk forskningsprogram når de opererer. Dette retinectomy er også utført stokastisk i hver enkelt tjeneste, slik at enklere måte å nå statistiske tall på er å arbeide med et nettverk. I et slikt nettverk, er standardisering av vev samling a...

Den viktigste terapeutiske målet i netthinneavløsning (RD) er å finne en måte å begrense fotoreseptoren celleskader og retinal betennelse som resulterer fra separeringen av de fra de retinale fotoreseptorer pigmenterte epitel-celler. Under RD, er RPE celler aktiveres, migrere dedifferentiate, og sprer på overflaten av frittliggende netthinnen, øve kontraktile krefter som fører til komplikasjoner. Transcriptomics analyse av RD er en måte å identifisere målgener med modifisert uttrykket etter RD og dermed fremtidige terapeutiske molekyler som kan forbedre endelige visuelle resultatet i kombinasjon med kirurgi. Det er velkjent ribonukleinsyre (RNA) ikke er stabilt som er deoksyribonukleinsyre (DNA), idet sistnevnte er i utstrakt bruk for genetiske studier, eventuelt at stabiliteten tillates sekvensering av Neanderthal genomet fra paleontological prøver av mer enn 30.000 år 2.. Transkripsjon av DNA av genene fra genomet til messenger RNA er detstor prosess i genekspresjon, og det mRNA som er labil for å utgjøre et signal. RNA er meget hurtig degradert av RNAse-enzymer som avsluttes signalet. Når vev er isolert fra en organisme, de RNA er svært ofte degradert før uttrykket er studert i et forskningslaboratorium. Degradert RNA er ikke egnet for analyse av genuttrykk. Fordi laboratoriet ansatte ikke kan delta i operasjonen, har vi utviklet en prosedyre som er enkel og krever bare at kirurgen å gjenopprette vev i en egnet RNAse løsning. RNA av vevet er stabil og kan analyseres uten noen tegn på nedbrytning etter 72 timer ved romtemperatur og i denne løsningen. The RNAs fra prøver blir renset ved en standardisert metode som involverer en ultrasentrifugering på en cesiumklorid gradient etter å ha blitt overført til laboratoriet 3.. Deretter blir kvaliteten av RNAer vurdert ved agarose-gelelektroforese og ved RT-PCR. RNA rensing protokollen harFordelen med å separere molekyler i henhold til deres tetthet som er forskjellig for DNA og RNA, og sikrer at RNA ikke blir forurenset med DNA-molekyler som vil generere artifactual signaler i genekspresjon studier. I tillegg er transfer RNA (tRNA), som er de mest tallrike kvantitativt RNA i en celle, og er adskilt i henhold til den samme fysiske egenskapen fra det ribosomale RNA (rRNAs) og messenger RNA (mRNA), de to siste er den Sluttproduktet av renseprosessen. Fjerningen av tRNA fra preparatet er nyttig siden det meste av mikromatriser analytiske protokoller involverte bruk av omvendt transcriptases og RNA polymeraser som er hemmet av tRNA 4-6. De rensede RNA fra Kirurgiske prøver blir merket ved anvendelse av standard-protokoll og hybridisert til en mikroarray chip og resultatene er analysert ved hjelp av to komplementære metoder, den såkalte falske-tode, og ved hjelp av en ny fremgangsmåte basert på gjensidig informasjon og visualiseringszed på web-basert server Retinobase 7,8.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Aventi J-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JS-5.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>LE 80K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>SW41</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Power supply</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>Pac 3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PolytronTM</td>
 <td>Kinematica</td>
 <td>PT 2100</td>
 <td>Supplied with PT-DA 2105:2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose gel electrophoresis device</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>MiniGel Cell GT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imaging System </td>
 <td>Biorad</td>
 <td>GelDoc-It Imager</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml sterile polyethylene tube</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>115261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile polyallomer centrifuge tube </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>331372</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemical reagents</td>
 <td>Sigma</td>
 <td></td>
 <td>Molecular biology grade (RNase and DNase free products)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cleaning Solution </td>
 <td>VWR </td>
 <td>RBS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microarray chip</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>Human U133 plus 2 array</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal

Netthinneavløsning (RD) beskriver en separasjon av nevrosensorisk netthinnen fra retinal pigmentert epitel (RPE). RPE er viktig for normal funksjon av de lysfølsomme nerveceller, fotoreseptorene. Avløsning av netthinnen fra RPE skaper en fysisk gap som er fylt med ekstracellulær væske. RD initierer cellulære og molekylære uønskede hendelser som påvirker både nevrosensorisk netthinnen og RPE siden den fysiologiske utveksling av ioner og metabolitter er sterkt opprørt. Konsekvensen for syn er knyttet til varigheten av løsgjøring da rask reapposition av de to vev resulterer i gjenopprettelse av syn 1.. Behandlingen av RD er utelukkende kirurgisk. Fjerning av glasslegemet gel (vitrektomi) etterfølges av fjerning av ikke essensiell del av netthinnen rundt det frittliggende område for å favorisere netthinneavløsning. De fjernede netthinnens eksemplarer er res nullius (ingenting) og følgelig normalt forkastet.For å gjenopprette RNA fra disse kirurgiske prøver, har vi utviklet prosedyren tidsskrift som gjør at RNA bevaring under overføringen fra kirurgisk blokk til laboratoriet. Vi har også en standardisert protokoll for å rense RNA ved cesiumklorid-ultrasentrifugering for å sikre at de rensede RNA er egnet for global genekspresjon analyse. Kvaliteten av RNA ble validert både med RT-PCR-analyse og mikromatrise. Analyse av data viser en samtidig involvering av betennelse og fotoreseptor degenerasjon under RD.

Fremgangsmåten Journal (figur 1) gjør det mulig for oss å gjenopprette prøvestykker av retina fra det kirurgiske blokken til renset RNA, og å analysere transcriptome av netthinneavløsning. Netthinneavløsning resulterer i oppregulering av monocytt kjemotaktisk MCP1 genet CCL2, og i reduksjon i uttrykket av stangen fotoreseptoren transducing genet GNAT1, kortbølge kjegle opsin OPN1SW, og homeogene CRX (figur 2). Induksjon av CCL2 er som...

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl at JoVE.com

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Vi brukte retinal prøver fra retinectomy for en transcriptomic analyse av netthinneavløsning. Vi har utviklet en fremgangsmåte som tillater RNA bevaring mellom de kirurgiske blokker og laboratoriet. Vi standardisert en protokoll for å rense RNA ved cesiumklorid-ultrasentrifugering for å sikre at de rensede RNA er egnet for mikroarray-analyse.

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Kirurgiske Prøver Bruke Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Forbedret protokoll For Laser mikrodisseksjon Of Human bukspyttkjertelen holmer Fra Kirurgiske prøver

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

To metoder for å etablere primær Menneskelig Livmor stromale celler fra Hysterektomi Prøver

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

En trinnvis protokoll for subretinal Surgery i kaniner

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Generering av en humanisert muselever med humane lever stamceller

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Intravital mikroskopi av svulst-assosiert blodkar benytter avansert Dorsal Skinfold vinduet Chambers på transgene fluorescerende mus

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Bruke In Vitro Live-celle Imaging for å utforske Chemotherapeutics levert av Lipid-baserte nanopartikler

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Surgical Training for the Implantation of Neocortical Microelectrode Arrays Using a Formaldehyde-fixed Human Cadaver Model

Kirurgisk opplæring for implantering av Neocortical Microelectrode matriser med formaldehyd-fast menneskelige Cadaver modell

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Diagnose og kirurgisk behandling av human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induksjon og analyse av oksidativt stress i sovende skjønnhet transposon-transfekterte humane retinal pigment epitelceller

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...