Name: transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal
Uploaded: 2013-08-14T13:00:00
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Damos las gracias a Sacha Reichman y Dominique Santiard-Baron por su ayuda en la edición del protocolo de purificación de RNA.

1. Diario: Procedimiento para recuperar las muestras del Bloque Quirúrgico En el laboratorio <ol><li> Obtenga un contrato de importación de la empresa de transporte expreso. </li><li> Llenar 10 (o 25) Formas de envío a la dirección postal del laboratorio que indica la persona de contacto en el laboratorio (número de teléfono y dirección de correo electrónico). </li><li> Preparar 10 (o 25) formas muestras numeradas del 1 al 10 (o 25). Estas formas incluyen espacios dedicados a informar...

<ol>
	<li>Mitry, D., Charteris, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+rhegmatogenous+retinal+detachment:+geographical+variation+and+clinical+associations.">The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations.</a> The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).</li><li>Green, R. E., Krause, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+sequence+of+the+Neandertal+genome.">A draft sequence of the Neandertal genome.</a> Science. 328 (5979), 710 (2010).</li><li>Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleic+acid+isolated+by+cesium+chloride+centrifugation.">Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation.</a> Biochemistry. 13 (12), 2633 (1974).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).</li><li>Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coli+tRNAs+as+inhibitors+of+viral+reverse+transcription+in+vitro.">coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).</li><li>Sawadogo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+inhibition+of+yeast+RNA+polymerases+A+and+B+by+tRNA+and+alpha-amanitin.">On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin.</a> Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).</li><li>Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+detachment+reveals+both+inflammatory+response+and+photoreceptor+death.">Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death.</a> PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).</li><li>Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RETINOBASE:+a+web+database,+data+mining+and+analysis+platform+for+gene+expression+data+on+retina.">RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina.</a> BMC Genomics. 9, 208 (2008).</li><li>Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+chemoattractant+protein+1+mediates+retinal+detachment-induced+photoreceptor+apoptosis.">Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).</li><li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases:+from+clinic+to+redox+signaling.">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).</li><li>Chalmel, F., Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).</li></ol>

El desarrollo de un procedimiento para la recuperación de los tejidos del bloque quirúrgico ha sido esencial para el análisis del transcriptoma de desprendimiento de retina. Uno debe darse cuenta de que este tipo de cirugía se practica en situaciones de emergencia y que el operativo oftalmólogos tienen poco tiempo para participar en un programa de investigación biológica cuando operan. Este retinectomía también se lleva a cabo estocásticamente en cada servicio, por lo que la forma más fácil de llegar a un n?...

El principal objetivo terapéutico en desprendimiento de retina (DR) es encontrar una manera de limitar el daño celular y la inflamación de la retina fotorreceptor resultante de la separación de los fotorreceptores de las células epiteliales pigmentadas de la retina. Durante RD, las células de RPE se activan, migran, dedifferentiate, y proliferan en la superficie de la retina desprendida, ejerciendo fuerzas contráctiles que conducen a complicaciones. Análisis Transcriptómica de RD es una manera de identificar los genes diana con la expresión modificada como consecuencia de RD y por lo tanto las futuras moléculas terapéuticas que podrían mejorar el resultado visual final en combinación con la cirugía. Es bien sabido ácido ribonucleico (ARN) no es estable como es el ácido desoxirribonucleico (ADN), este último siendo utilizado ampliamente para estudios genéticos, su estabilidad había permitido la secuenciación del genoma del Neandertal a partir de muestras paleontológicos de más de 30.000 años de edad 2. La transcripción de ADN de los genes del genoma en ARN mensajero es laimportante proceso en la expresión génica, y el ARNm es lábil con el fin de constituir una señal. RNAs son rápidamente degradados por las enzimas ARNasa que terminan la señal. Cuando los tejidos se aíslan a partir de un organismo, los ARN son muy a menudo degrada antes de la expresión se estudió en un laboratorio de investigación. ARN degradados no es adecuado para el análisis de la expresión génica. Debido a que el personal de laboratorio no puede participar en la cirugía, se desarrolló un procedimiento que es fácil y sólo requiere que el cirujano para recuperar los tejidos en una solución de RNasa libre apropiado. Los ARN de los tejidos es estable y pueden ser analizados sin ningún signo de degradación después de 72 horas a temperatura ambiente en esta solución. Los ARN a partir de muestras se purifican por un método normalizado que implica una ultracentrifugación en un gradiente de cloruro de cesio después de haber sido transferidos al laboratorio 3. Entonces, la calidad de los ARN se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa y por RT-PCR. El protocolo de purificación de ARN tiene laventaja de separar las moléculas de acuerdo con su densidad que es diferente para el ADN y el ARN y asegura que el ARN no está contaminado por unas moléculas de ADN que generarán señales de artefactos en estudios de expresión génica. Además, los ARN de transferencia (ARNt), que son cuantitativamente los ARN más abundantes dentro de una célula, se separan de acuerdo con la misma propiedad física a partir del ARN ribosómico (ARNr) y los ARN mensajeros (ARNm), estos dos últimos uno de ellos el el producto final del proceso de purificación. La eliminación de ARNt de la preparación es útil ya que la mayoría de los protocolos de análisis de microarrays implicado el uso de transcriptasas inversas y polimerasas de ARN que son inhibidas por el ARNt 4-6. El ARN purificado a partir de muestras quirúrgicas están etiquetadas utilizando el protocolo estándar y se hibridan a un chip de micromatriz y los resultados se analizaron usando dos métodos complementarios, el método de la tasa de falso descubrimiento, y el uso de un nuevo método basado en la información mutua y visualized en el servidor basado en web Retinobase 7,8.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Aventi J-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JS-5.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>LE 80K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>SW41</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Power supply</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>Pac 3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PolytronTM</td>
 <td>Kinematica</td>
 <td>PT 2100</td>
 <td>Supplied with PT-DA 2105:2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose gel electrophoresis device</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>MiniGel Cell GT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imaging System </td>
 <td>Biorad</td>
 <td>GelDoc-It Imager</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml sterile polyethylene tube</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>115261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile polyallomer centrifuge tube </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>331372</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemical reagents</td>
 <td>Sigma</td>
 <td></td>
 <td>Molecular biology grade (RNase and DNase free products)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cleaning Solution </td>
 <td>VWR </td>
 <td>RBS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microarray chip</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>Human U133 plus 2 array</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal

El desprendimiento de retina (DR) describe una separación de la retina neurosensorial del epitelio pigmentario de la retina (RPE). El RPE es esencial para la función normal de las neuronas sensibles a la luz, los fotorreceptores. Desprendimiento de la retina de la RPE crea una brecha física que se llena con el fluido extracelular. RD inicia los eventos adversos celulares y moleculares que afectan tanto a la retina neurosensorial y el EPR ya que el intercambio fisiológico de iones y metabolitos se ve gravemente perturbado. La consecuencia para la visión está relacionada con la duración de la separación desde una rápida reapposition de los dos tejidos en los resultados de la restauración de la visión 1. El tratamiento de la RD es exclusivamente quirúrgico. La eliminación del gel vítreo (vitrectomía) es seguido por la eliminación no parte esencial de la retina alrededor de la zona individual para favorecer el desprendimiento de retina. Las muestras de retina retirados son res nullius (nada) y por lo tanto normalmente se desechan.Para recuperar el ARN de estas piezas quirúrgicas, desarrollamos el Diario procedimiento que permite la conservación de ARN durante la transferencia del bloque quirúrgico para el laboratorio. También estandarizado un protocolo para purificar el ARN mediante ultracentrifugación cloruro de cesio para asegurar que los ARN purificados son adecuados para el análisis de la expresión génica global. La calidad del ARN fue validado tanto por RT-PCR y análisis de microarrays. El análisis de los datos muestra una participación simultánea de la inflamación y degeneración de los fotorreceptores durante RD.

El procedimiento de auditoría (Figura 1) permite recuperar muestras de retina del bloque quirúrgico para ARN purificado, y para analizar el transcriptoma de desprendimiento de retina. Resultados de desprendimiento de retina en la regulación al alza de la quimiotáctica de monocitos MCP1 gen CCL2, y en la disminución de la expresión de la varilla fotorreceptor transducir gen GNAT1, el cono de onda corta opsina OPN1SW, y la homeogene CRX (Figura 2).</strong...

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Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Utilizamos muestras de la retina de retinectomía para un análisis transcriptomic de desprendimiento de retina. Hemos desarrollado un procedimiento que permite la conservación de RNA entre los bloques quirúrgicos y el laboratorio. Se estandarizó un protocolo para purificar el ARN mediante ultracentrifugación en cloruro de cesio para asegurar que los ARN purificados son adecuados para el análisis de microarrays.

Análisis Transcriptomic de especímenes quirúrgicos retina humana usando Diario

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Método para el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer utilizando explantes tumorales de las piezas quirúrgicas


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Investigación

Medicina

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Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...