Name: transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal
Uploaded: 2013-08-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl at JoVE.com

Vi tackar Sacha Reichman och Dominique Santiard-Baron för deras hjälp med att redigera RNA reningsprotokollet.

Ett. Journal: förfarandet för att uppbära Prover från Surgical Block I labbet <ol><li> Få en import kontrakt från expressfrakt företag. </li><li> Fyll 10 (eller 25) sjöfart former med postadress på laboratoriet anger kontaktperson i laboratoriet (telefonnummer och e-postadress). </li><li> Förbered 10 (eller 25) prover former numrerade 1 till 10 (eller 25). Dessa former omfattar särskilda utrymmen för att informera om a) anonym identifiering av patienten, b) dagen för kirurgi och ...

<ol>
	<li>Mitry, D., Charteris, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+rhegmatogenous+retinal+detachment:+geographical+variation+and+clinical+associations.">The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations.</a> The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).</li><li>Green, R. E., Krause, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+sequence+of+the+Neandertal+genome.">A draft sequence of the Neandertal genome.</a> Science. 328 (5979), 710 (2010).</li><li>Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleic+acid+isolated+by+cesium+chloride+centrifugation.">Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation.</a> Biochemistry. 13 (12), 2633 (1974).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).</li><li>Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coli+tRNAs+as+inhibitors+of+viral+reverse+transcription+in+vitro.">coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).</li><li>Sawadogo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+inhibition+of+yeast+RNA+polymerases+A+and+B+by+tRNA+and+alpha-amanitin.">On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin.</a> Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).</li><li>Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+detachment+reveals+both+inflammatory+response+and+photoreceptor+death.">Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death.</a> PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).</li><li>Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RETINOBASE:+a+web+database,+data+mining+and+analysis+platform+for+gene+expression+data+on+retina.">RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina.</a> BMC Genomics. 9, 208 (2008).</li><li>Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+chemoattractant+protein+1+mediates+retinal+detachment-induced+photoreceptor+apoptosis.">Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).</li><li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases:+from+clinic+to+redox+signaling.">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).</li><li>Chalmel, F., Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).</li></ol>

Utvecklingen av ett förfarande för vävnad återhämtning från kirurgiska blocket har varit avgörande för transkriptomanalys av näthinneavlossning. Man bör notera att denna typ av kirurgi praktiseras i nöd och att ögonläkare operativsystemet har lite tid för att delta i ett biologiskt forskningsprogram när de är verksamma. Denna retinectomy utförs också stokastiskt i varje tjänst, så att det enklare sätt att nå statistiska siffror är att arbeta med ett nätverk. I ett sådant nätverk, är standardis...

Den huvudsakliga terapeutiska mål i näthinneavlossning (RD) är att hitta ett sätt att begränsa skadorna fotoreceptorcell och retinal inflammation som resulterar från separationen av fotoreceptorer från de retinala pigmenterade epitelceller. Under RD, är RPE-celler aktiveras, migrera, dedifferentiate och föröka sig på ytan av näthinneavlossning, utövar sammandragande krafter som leder till komplikationer. Transkriptomik analys av RD är ett sätt att identifiera målgener med modifierad uttryck efter RD och därmed framtida terapeutiska molekyler som skulle kunna förbättra slutliga visuella resultatet i kombination med kirurgi. Det är väl känt ribonukleinsyra (RNA) är inte stabil som är deoxiribonukleinsyra (DNA), varvid den senare används i stor utsträckning för genetiska studier, hade dess stabilitet tillät sekvensering av neandertalarnas genom från paleontologiska prover av mer än 30.000 år 2. Transkription av DNA av generna från genomet till budbärar-RNA är denviktig process i genuttryck, och mRNA är labil för att utgöra en signal. RNA är mycket snabbt bryts ned av RNAse enzymer som avslutar signalen. När vävnaderna isoleras från en organism, de RNA är ofta nedsatt före uttrycket studeras i ett forskningslaboratorium. Degraderade RNA är inte lämpligt för analys genuttryck. Eftersom laboratoriet personalen inte kan delta i operationen, utvecklade vi ett förfarande som är enkelt och kräver bara att kirurgen att återställa vävnader till ett lämpligt RNAse-fri lösning. De RNA av vävnaderna är stabil och kan analyseras utan några tecken på nedbrytning efter 72 h vid rumstemperatur i denna lösning. De RNA från prover renas genom en standardiserad metod som innebär en ultracentrifugering på en cesiumkloridgradient efter att ha överförts till laboratoriet 3. Därefter, är kvaliteten på de RNA bedömas av agarosgelelektrofores och med RT-PCR. RNA reningsprotokoll harfördel att separera molekyler enligt deras densitet som är olika för DNA och RNA och säkerställer att RNA inte är förorenad av en DNA-molekyler som kommer att generera artefaktuella signaler i genuttrycksstudier. Dessutom är de transfer-RNA (tRNA), som är kvantitativt de mest förekommande RNA inuti en cell, separeras enligt samma fysikaliska egenskapen från det ribosomala RNA (rRNA) och budbärar-RNA (mRNA), de två senaste är den slutprodukten av reningsprocessen. Avlägsnandet av tRNA från beredningen är användbart eftersom de flesta av microarray analysprotokoll innefattade användning av omvänt transkriptas och RNA polymeraser som hämmas av tRNA 4-6. De renade RNA från kirurgiska preparat är märkta enligt standardprotokoll och hybridiserades till en mikromatrisskivan och resultaten analyseras med två kompletterande metoder, den falska upptäckten dagskursmetoden, och med hjälp av en ny metod som bygger på ömsesidig information och visualiseringzed på webbaserade server Retinobase 7,8.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Aventi J-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JS-5.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>LE 80K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>SW41</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Power supply</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>Pac 3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PolytronTM</td>
 <td>Kinematica</td>
 <td>PT 2100</td>
 <td>Supplied with PT-DA 2105:2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose gel electrophoresis device</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>MiniGel Cell GT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imaging System </td>
 <td>Biorad</td>
 <td>GelDoc-It Imager</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml sterile polyethylene tube</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>115261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile polyallomer centrifuge tube </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>331372</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemical reagents</td>
 <td>Sigma</td>
 <td></td>
 <td>Molecular biology grade (RNase and DNase free products)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cleaning Solution </td>
 <td>VWR </td>
 <td>RBS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microarray chip</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>Human U133 plus 2 array</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal

Näthinneavlossning (RD) beskriver en separation av sensorineural näthinnan från retinala pigmenterade epitel (RPE). RPE är viktigt för normal funktion av ljuskänsliga nervceller, fotoreceptorer. Detachment av näthinnan från RPE skapar ett fysiskt gap som är fylld med extracellulär vätska. RD initierar cellulära och molekylära biverkningar som påverkar både sensorineural näthinnan och RPE eftersom den fysiologiska utbyte av joner och metaboliter allvarligt störs. Konsekvensen för visionen är relaterad till den tid lossnar sedan en snabb reapposition av de två vävnader resulterar i restaurering av visionen 1. Behandlingen av RD är enbart kirurgiskt. Borttagning av glaskroppen gel (vitrektomi) följs av avlägsnande icke väsentlig del av näthinnan runt fristående område att favorisera näthinneavlossning. De avlägsnade retinal exemplar är res nullius (ingenting) och följaktligen normalt kasseras.Att återvinna RNA från dessa kirurgiska exemplar, utvecklade vi proceduren Journal som gör RNA beskydd under överföringen från kirurgiska blocket till laboratoriet. Vi har också standardiserat ett protokoll för att rena RNA från cesiumklorid ultracentrifugering för att säkerställa att de renade RNA är lämpliga för global genuttrycksanalys. Kvaliteten på RNA validerades både genom RT-PCR och microarray analys. Analys av data visar en samtidig medverkan av inflammation och ljusmätare degeneration under RD.

Förfarandet Journal (figur 1) ger oss återvinna exemplar av näthinnan från kirurgiska blocket till renat RNA, och att analysera transcriptomen av näthinneavlossning. Näthinneavlossning resulterar i uppreglering av monocytkemotaktisk MCP1 gen CCL2, och i en minskning i uttryck av stången fotoreceptor transducerande gen GNAT1, den kortvågs konen opsin OPN1SW och homeogene CRX (Figur 2). Induktionen av CCL2 leder från inflammation ...

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl at JoVE.com

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Vi använde retinal prover från retinectomy för en transcriptomic analys av näthinneavlossning. Vi utvecklade ett förfarande som gör RNA bevarande mellan de kirurgiska blocken och laborationer. Vi standardiserat ett protokoll för att rena RNA från cesiumklorid ultracentrifugering för att säkerställa att de renade RNA är lämpliga för microarray analys.

Transcriptomic Analys av mänskliga Retinal Kirurgiska prover med tidning

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Metod för Novel läkemedel mot cancer utveckling med hjälp av tumör explants av kirurgiska preparat


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Förbättrad protokoll för laser mikrodissektion av humana pankreasöar från kirurgiska prover

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Två metoder för att fastställa Primära Human Endometrial stromaceller från Hysterectomy Prover

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

En steg för steg protokoll för subretinal kirurgi i kaniner

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Generering av en humaniserad muslever Använda Human lever stamceller

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Intravital mikroskopi av tumör-associerad vaskulatur använder avancerade dorsala Skinfold fönster Chambers på transgena fluorescerande möss

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Med In Vitro Live-cell Imaging att utforska kemoterapeutika levereras av Lipid-baserade nanopartiklar

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Surgical Training for the Implantation of Neocortical Microelectrode Arrays Using a Formaldehyde-fixed Human Cadaver Model

Kirurgisk träning för Implantation av hjärnbarkens mikroelektrod matriser använder en modell med formaldehyd-fast mänskliga Cadaver

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Diagnos och kirurgisk behandling av human brucellar spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induktion och analys av oxidativ stress i Törnrosa Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epitelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...