Name: visualization and analysis of mrna molecules using fluorescence in situ hybridization in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2013-06-14T13:00:00
Duration: 7 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies GM046406 (DB) en door het Nationale Instituut van Algemene Medische Wetenschappen Centrum voor Quantitative Biology (GM071508). RSM erkent financiering van de NSF Graduate Research Fellowship. MNM wordt ondersteund door een Lewis-Sigler Fellowship. We willen graag de leden van de Botstein lab erkennen voor behulpzaam discussies en de voormalige leden Allegra Petti en Nikolai Slavov voor hun bijdragen aan het metabole cyclus project. Wij danken Daniel Zenklusen en Robert Singer voor het krijgen van ons begonnen met de FISH-methode.

Figuren 1 en 2 zijn schema&#39;s van de FISH experimentele procedures en beeldanalyse pijpleiding voor FISH kwantificering afbeeldingen. 1. Oplossingen voor te bereiden * Onderstaande oplossingen zijn voor gebruik met Singer sondes. Bij gebruik Stellaris sondes, vervang &quot;40% formamide&quot; met &quot;10% formamide&quot; in zowel Hybridisatiebuffer en Wash Buffer. Aanvullende wijzigingen aan Hybridisatiebuffer bij het gebruik Stellaris sondes zijn (1) voeg 1 g dextransulfaat en (2) zijn exclusief 10 mg ssDNA. Buffer B 8 ml 1 M KH 2 PO 4 41,5 ml 1M K 2 HPO 4 109,3 g Sorbitol Spheroplasting Buffer 890 ul buffer B 100 gl VRC 10 ul 25.000 U / ml Lyticase 2 pl β-mercaptoethanol &lt;strong&gt; hybridisatiebuffer (10 ml, eindvolume) 10 mg E. coli tRNA 10 mg ssDNA * 100 ul 200 mM VRC voorraad 40 ui van 50 mg / ml BSA 1 ml 20X SSC 4 ml 40% formamide * Nuclease Free Water (tot 10 ml eindvolume) 1 g Dextran Sulfate * * Hybridization Buffer kan in 0,5 ml aliquots gemakshalve worden bewaard bij -20 ° C. Wash Buffer (50 ml, eindvolume) 5 ml 20X SSC 20 ml 40% formamide * Nuclease Free Water (tot 50 ml eindvolume) Labeling Buffer 1.06 g Natrium Carbonaat 100 ml DEPC Water pH 9 2. Probe-labeling (Singer Probes Only) We krijgen deze probes door in-house-synthese met behulp van een ABI oligonucleotidesynthese apparaat. Typically worden 4-5 ~ 50 bp gesynthetiseerde oligonucleotiden die homoloog zijn aan het gen van belang, vervangende amino-allyl thymidine meerdere thymidinen afstand ten minste 8, bij voorkeur 10 bp + elkaar. Vanwege hun gevoeligheid voor ozon, werken we in een ozon-free voorziening bij het gebruik van CY kleurstoffen. <ol><li> Verkrijgen ~ 5 sondes en resuspendeer in 100 pl water - check concentraties op Nanodrop. </li><li> Afhankelijk van het aantal probes / gen gecombineerd totaal van 10 ug oligonucleotiden / gen (bijvoorbeeld als probes zijn 5 / gen, dan wil 2 ug / probe). </li><li> Gebruik QIAquick kolommen probes zuiveren volgens QIAquick Nucleotide Removal Kit Protocol. </li><li> Voeg 10 volumes buffer PN het volume van gecombineerde probes en meng totaal. </li><li> Toepassing monster te QIAquick column - als totale volume groter is dan 750 ul, spin down tweemaal met de helft van het volume in elke spin </li><li> Laat staan ​​voor 1 min. </li><li> Centrifugeer 1 min bij 6000 rpm. </li><li> Wassen met 750 ul buffer PE. </li><li> Centrifuge1 min bij 6000 rpm. </li><li> Gooi doorstroming en opnieuw spinkolom gedurende 1 min bij 13.000 rpm te drogen. </li><li> Column plaats QIAquick in nieuwe microcentrifugebuis en elueer DNA met 50 ul H 2 O - Zorg dat H 2 O pH is binnen 7.0 en 8.5 en is direct geplaatst op membraan. </li><li> Laat staan ​​voor 1 min. </li><li> Centrifugeer gedurende 1 min bij 13.000 rpm om DNA te elueren. </li><li> Lyofiliseren DNA bij 45 ° C. </li><li> Resuspendeer pellet in 10 ul etikettering buffer en voeg aan buis van kleurstof zonder het aanraken van de kleurstof. </li><li> Herhalen met een andere 10 pl labeling buffer. </li><li> Vortex en spin down tube kleurstof en DNA. </li><li> Bedek buizen met aluminiumfolie en in het donker bewaren bij RT O / N te labelen. </li><li> Herhaal QIAquick Nucleotide Removal Kit Protocol. Voeren met twee verschillen: - Voeg 200 ul PN buffer om sondes en zet gelabelde probes door kolommen 2x. - Voer 3 wassingen met buffer PE om weg te wassen alle losse kleurstof voor elutie. </li><li> After elutie verkrijgen concentratie via nanodrop. De etikettering efficiëntie is meestal ~ 0.25 pmol / ng enkelstrengs DNA. </li></ol> 3. Dekglaasje Voorbereiding <ol><li> Plaats dekglaasjes op dia&#39;s in plasma-preen vacuümkamer ( <a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a> ) (hoe dichter bij het ​​centrum hoe beter). </li><li> Zet vacuümkamer magnetron en zorg ervoor dat het is verzegeld. </li><li> Schakel de pomp eerst zet vacuüm slechts eenmaal pomp wordt gestart. </li><li> Zet magnetron en stop 5 seconden na plasma zichtbaar. </li><li> Schakel vacuüm dan pomp. </li><li> Trek vacuümkamer en dekglaasjes te verwijderen met een pincet (degenen die zijn gevallen opnieuw moeten worden gereinigd). </li><li> Plaats dekglaasjes schoongemaakt kant op in 12-well platen. </li></ol> 4. Fixatie Procedure <ol><li> Groeien gist om een OD 600 van ongeveer 0,1-0,2 in minimale media. 10 ml cellen levert voldoende for ~ 10 aparte kruisingen. </li><li> Voeg 1/10 volume 37% formaldehyde rechtstreeks aan de groei media (10 ml van de cultuur + 1 ml 37% formaldehyde) en laat zitten voor 45 minuten. </li><li> 2x wassen met 1 ml ijskoude buffer B in een microcentrifugebuis (kan draaien bij 13.000 rpm gedurende 1 minuut). </li><li> Voeg 1 ml van spheroplasting buffer. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Controleer cellen elke paar minuten onder de microscoop tot de meeste cellen zijn zwart (dus niet fase-fel). </li><li> Wassen 2x met ijskoude buffer B, spinnen bij een lage snelheid (~ 3500 rpm). </li><li> Voeg 1 ml 70% EtOH, resuspendeer zacht en laat overnacht bij 4 ° C (kan oneindig bewaard bij -20 ° C). </li></ol> 5. Hybridisatie Procedure <ol><li> Bereid de hybridisatieoplossing: 100 gl hybridisatiebuffer, voeg 1-3 ui sonde, dan vortex en centrifuge. Zanger sondes gebruiken 8-10 ng totaal per probe set (dwz per gen). We hebben gelijktijdig belicht tot 3 genen met 3 diflende gemerkte probe sets. </li></ol> Zorg ervoor dat de hybridisatie-oplossing op kamertemperatuur komen alvorens het te openen. Voor Stellaris sondes wordt aanbevolen om 4 aparte hybridisatiereacties beginnen met het toevoegen van 1 pl elk van 1:10, 1:20, 1:50 en 1:100 werkverdunningen van probes om te zien welke optimaal is. Werkverdunningen van Stellaris probes worden bereid in hybridisatie buffer. <ol start="2"><li> Centrifuge (voor alle volgende stappen, 3500 rpm, 5 min) van de vaste cellen (bv. 200 pl) en zuig weg van de ethanol. </li><li> Voorzichtig hersuspenderen in 1 ml wasbuffer die hetzelfde percentage formamide de hybridisatie buffer bevat. Laat staan ​​voor 2-5 minuten. </li><li> Centrifugeer monster en aspireren wasbuffer, voeg dan hybridisatie-oplossing. Incubeer in het donker met zacht schudden, O / N bij 37 ° C. </li></ol> Opmerking: de volgende procedure is voor het aanbrengen / beeldvorming cellen op dekglaasjes. Voor wverassen / beeldvorming cellen in 96-well platen, waaronder alternatieve reactieve zuurstofradicalen scavenger oplossing zien <a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.</a> <ol start="5"><li> De volgende dag, of vooraf schoon (zie werkwijze) en behandel dekglaasjes met 150 ul 0.01% Poly-L-Lysine gedurende 5 minuten. Aspireren, laten drogen, wassen 3x met dH 2 O en laat drogen. </li><li> In de ochtend, voeg 1 ml wasbuffer aan het monster voorzichtig resuspenderen, centrifuge en zuig vervolgens hersuspenderen in een 1 ml wasbuffer en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Wassen met 2X SSC + 0,1% Triton X-100 bij kamertemperatuur 15 min te shaker. </li><li> Neem montage medium uit vriezer om deze te komen tot kamertemperatuur voor de montage. </li><li> Wassen met 1X SSC bij RT 15 min. op shaker. </li><li> Verdun DAPI in PBS (0,1 ug / ml eind) en resuspendeer cellen in 150 pi. </li><li> Plaats oplossing op gereinigd / poly-lys-Treated dekglaasjes in 12-well plaat; minstens 30 minuten ongestoord. </li><li> Verwijder oplossing (u kunt het op een reserve dekglas als back-up) en was 3x met 1 ml 1X PBS. </li><li> Plaats 3 pi Verleng Gold montage medium op een dia (Invitrogen P36934). Doe dit een voor een als u meerdere dekglaasjes te voorkomen dat ze uitdrogen van montage medium. </li><li> Voeg ~ 0,5 ml ethanol te dekglaasje in 12-well plaat, verwijder het deksel slip en lucht drogen terwijl het houden met een pincet. </li><li> Plaats dekken slip cel-kant naar beneden op montage medium en laat uitharden enkele uren of O / N in het donker. </li><li> Dicht de randen met nagellak en ga verder met beeldvorming. </li></ol> 6. Beeldvorming van Cellen met Olympus IX-81 Omgekeerde Microscoop Overzicht <ol><li> Voor het verwerven benutten we Slidebook (intelligent-imaging.com) software en een 100X, 1,45 NA, TIRFM olie doelstelling. Voor seriële GFP, DAPI, Cy3, Cy3.5 en Cy5 beeldvorming: Chroma filter sets (zie reagentia). </li><li> Gebruik DAPI filterte vinden en te concentreren cellen. </li><li> Stel deze als referentiepunt. </li><li> Neem een ​​z-stack van beelden rond het referentiepunt wanneer de totale afstand is 5 uM met 0,2 uM grootte (25 vliegtuigen). Herhaal dit voor elke kleurstof kanaal (dwz elke probe set). </li><li> Exporteren als een 16-bits TIFF voor beeldanalyse. </li></ol> 7. Image Analysis Overzicht (Singer Probes) Hieronder geven we een overzicht van computationele methoden die we gebruiken voor het analyseren van FISH afbeeldingen in MATLAB. De desbetreffende MATLAB functies gebruikt worden tussen haakjes aan de rechterkant. De algoritmes en drempels worden momenteel afgestemd op gegevens van Singer stijl sondes. Met behulp Stellaris stijl sondes zal enige aanpassing, met name voor de laatste filtering stap (7.8) nodig. Cell 15 Identificatie <ol><li> Afzonderlijke cellen van achtergrond met behulp van een algemene drempel op DAPI beelden 16 [graythresh]. </li><li> Identificeer kernen met behulp van uitgebreide maxima functie [imextendedmax]. </li><li> Segment cellen met kernen als zaden voor een waterscheiding algoritme [waterscheiding]. </li></ol> Vindplaatsen in elke fluorescentiekanaal <ol start="4"><li> Voeren tophat transformatie naar achtergrond normaliseren en signaal te verbeteren ruisverhouding [bwmorph]. </li><li> Zoek maxima aan de in-focus laag (in de z-vlak) te identificeren voor elke spot [imregionalmax]. </li><li> Filteren potentiële plekken met een lineaire fit model om een ​​radiaal verloop. </li></ol> Maatregel spot intensiteit en filter enkelvoudige versus meervoudige sonde signalen <ol start="7"><li> Monteer een 2D Gaussiaans profiel naar de plek in de eerder geconstateerde in-focus laag en raming intensiteit 17. </li><li> Filteren op zwakke plekken met een drempel (op basis van histogram). Voor Singer soort probes is dit belangrijk, maar is minder voor Stellaris sondes. </li><li> Telling spots in elke cel. </li></ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li><li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+Detection+of+Rna-DNA+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations.">Formation and Detection of Rna-DNA Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 63, 378 (1969).</li><li>Jones, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+and+Nuclear+Location+of+Mouse+Satellite+DNA+in+Individual+Cells.">Chromosomal and Nuclear Location of Mouse Satellite DNA in Individual Cells.</a> Nature. 225, 912 (1970).</li><li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA.">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li><li>Singer, R. H., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+gene+expression+visualized+in+chicken+muscle+tissue+culture+by+using+in+situ+hybridization+with+a+biotinated+nucleotide+analog.">Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7331-7335 (1982).</li><li>Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+cycling+in+single+yeast+cells+from+unsynchronized+steady-state+populations+limited+on+glucose+or+phosphate.">Metabolic cycling in single yeast cells from unsynchronized steady-state populations limited on glucose or phosphate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6946-6951 (2010).</li><li>Trcek, T., Larson, D. R., Moldon, A., Query, C. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mRNA+decay+measurements+reveal+promoter-+regulated+mRNA+stability+in+yeast.">Single-molecule mRNA decay measurements reveal promoter- regulated mRNA stability in yeast.</a> Cell. 147, 1484-1497 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li><li>Gandhi, S. J., Zenklusen, D., Lionnet, T., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+functionally+related+constitutive+genes+is+not+coordinated.">Transcription of functionally related constitutive genes is not coordinated.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 27-34 (2011).</li><li>Itzkovitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+transcript+counting+of+stem-cell+markers+in+the+mouse+intestine.">Single-molecule transcript counting of stem-cell markers in the mouse intestine.</a> Nature Cell Biology. 14, 106-U193 (2012).</li><li>Raj, A., Rifkin, S. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+gene+expression+underlies+incomplete+penetrance.">Variability in gene expression underlies incomplete penetrance.</a> Nature. 463, 913-U984 (2010).</li><li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes.">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472 (10), 365-386 (2010).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).</li><li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tlreshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Tlreshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li><li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22, 4447-4459 (2011).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9, 743-U159 (2012).</li><li>Levsky, J. M., Shenoy, S. M., Pezo, R. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+profiling.">Single-cell gene expression profiling.</a> Science. 297, 836-840 (2002).</li><li>Wyart, M., Botstein, D., Wingreen, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Gene+Expression+Dynamics+Using+Pairwise+RNA+FISH+Data.">Evaluating Gene Expression Dynamics Using Pairwise RNA FISH Data.</a> Plos Computational Biology. 6, (2010).</li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Tot op heden heeft FISH primair is een low-throughput-methode. Het gebruik van Cy3, Cy3.5, Cy5 kleurstoffen en beperkt het aantal genen kan onderzoeken enkelvoudige cellen tot drie tegelijk. Sommige extra probes ontwikkeld (Stellaris) maar het aantal onderscheiden probes nog maximaal zeven. Om deze beperking te omzeilen, hebben combinatorische etikettering strategieën door middel van meerdere fluoroforen gebruikt om barcodes voor verschillende mRNA moleculen 19,20 creëren. Meest recent, Lübeck en Cai gebruikte optische en spectrale barcoding om 32 verschillende soorten tegelijk te kwantificeren met FISH in enkele gistcellen 19. Een beperking van deze recente combinatoriële benadering vereist het gebruik van superresolutietechnieken. De analyse nodig barcode probes onderscheiden is vrij complex. Wij hebben gevonden dat Cy3 en Cy3.5 de voorkeur om Cy5 voor FISH experimenten. Een van de beperkingen van de Cy5 kleurstof de gevoeligheidaan fotobleken. Echter, heeft Stellaris recent ontwikkelde Cy5 varianten die worden aangeboden als beter bestand tegen photobleaching, en kan deze technische kwestie te verlichten. Ook vermeldenswaard dat FISH is een dure methode te implementeren en dat zowel Singer en Stellaris sondes meestal kost $ 700 - $ 1.000 per probe set, hoewel de prijzen voor commercieel beschikbare sondes moeten afnemen in de toekomst. Sparen van reagentia en efficiënte etikettering brengt Singer sondes naar de lagere variëren in prijs. Een van de grote technische uitdagingen is de scheiding van enkelvoudige versus meervoudige sondespots, die de uitvoering van geavanceerde algoritmes spot-bepaling vereist. Dit kan uitgebreide handmatige nemen om beeldanalyse parameters afstemmen voor specifieke experimentele opstellingen. Een overzicht van onze computationele pijplijn met relevante MATLAB functies is te vinden in hoofdstuk 7 van het protocol. Dit probleem wordt enigszins verlicht door de Stellaris sondes die slechts<html> een label per sonde. Het vereist dan ook de colocalization van meerdere sondes om een ​​signaal te zien. Omdat FISH noodzakelijk vaststelling cellen, maakt het niet gemakkelijker bijhouden van individuele cellen in de tijd. Voorheen FISH snapshot data gebruikten we om de dynamiek van genexpressie te reconstrueren in individuele metabolisch fietsen gist bevolking 6. Metabole fietsen wordt waargenomen in pre-uitgehongerd continue culturen, en wordt gekenmerkt door de gehele bevolking collectieve oscillaties in zuurstofconsumptie. Deze trillingen worden geassocieerd met genoom-brede oscillaties van transcripten die liggen voor de helft van gist genen in verschillende fasen van zuurstofverbruik. We zochten om te bepalen of metabole fietsen aanwezig in niet-gesynchroniseerde continue gistculturen was. Indien aanwezig moet transcripten die anti-gecorreleerd synchrone populaties ook anti-gecorreleerde in gesynchroniseerde afzonderlijke cellen en vice versa voor gecorreleerde transcripten. ent &quot;&gt; Naar dynamiek van mRNA productie tijd reconstrueren moeten de geobserveerde momentopname gegevens worden vergeleken met wat wordt verwacht van een model van het onderliggende gedrag. zijn theoretische beperkingen wanneer dergelijke&quot; snapshots &quot;van genexpressie gegevens worden bepaald de onderliggende genexpressiedynamica en welke soorten modellen onderscheiden 21. Voor de metabole cyclusgegevens, in plaats van direct met de aanwezigheid van tijdelijke schommelingen, werden statistische metingen uitgevoerd onderbouwen dat er inderdaad een cel autonoom oscillerende programma in overeenstemming met bulk microarray metingen.

Met behulp bulk meettechnieken, is het niet mogelijk om het assay aantal transcripten of transcriptionele activiteit in afzonderlijke cellen 1. Gebruik van fluorescente proteïnen gedreven door promoters plaats als reporters van genexpressie kan dit probleem tot op zekere hoogte, maar de tijd die fluorescerende eiwitten vouwen verduistert vroeg dynamiek. Langlevende fluorescente proteïnen kunnen evenmin mRNA levens melden. De FISH werkwijze kan worden gebruikt om mRNA assay gedurende de volledige levenscyclus van transcriptie-initiatie in de kern van latere rijping en bederf in enkele cellen, met enkele molecule resolutie. Het origineel in situ experimenten visualiseren gebruikte nucleïnezuren radioactief gemerkt RNA probes DNA elementen sonde. Deze omvatten het visualiseren van ribosomaal DNA in de eierstokken van de kikker Xenopus laevis 2 en satelliet-DNA in de muis weefsel 3. De eerste fluorescente in situ expertiserimentele gebruikt een RNA-molecuul gemerkt met een fluorofoor bepaalde DNA-sequenties sonde 4. De eerste toepassing van fluorescerende probes voor het visualiseren RNA in situ werd de visualisatie van actine genexpressie in kip spierweefsel cultuur 5. Meer recent, in gist, FISH is gebruikt om oscillaties te onderzoeken transcriptie tijdens de gist metabolische cyclus 6, het verval van mRNA in celcyclusprogressie 7 en ruimtelijke lokalisatie van mRNA transcripten tijdens mitose 8. FISH is gebruikt in gist te laten zien dat niet-gecorreleerde fluctuaties in constitutief getranscribeerd genen, die vormen meer dan de helft van alle gist genen, ontstaan ​​uit niet-gecorreleerde transcriptie initiatie 9. In niet-gistsoorten, is FISH gebruikt om stamcellen markers in de muis darm 10 is en te bepalen dat onvolkomen van celtypes kunnen voortvloeien uit stochastische genexpressie fluctuaties in C.elegans embryo 11. De FISH werkwijze beschreven werkt door het hybridiseren kleurstof gemerkte enkelstrengs DNA probes om berichten mRNA. Cellen worden afgebeeld en mRNA&#39;s worden geteld met behulp van een spot-detectie algoritme. Enkelstrengs probes kunnen worden gegenereerd met een DNA synthesizer en vervolgens gemerkt (hier aangeduid als Singer probes) of bestelde commercieel als pre-gelabelde probes (Stellaris probes) 12,13. Een belangrijk verschil tussen de Singer Stellaris probes is dat de Singer probes langer (-50 bp) en zijn multi-gemerkte terwijl de Stellaris probes zijn kort (-20 bp) met slechts een label per probe, zoals beschreven door Raj et al. 14. Bovendien, de Stellaris benadering gebruikt veel meer probes per gen dan Singer (~ 30 versus 5 probes per gen respectievelijk). Hieronder geven we een protocol dat het gebruik van elk soort probe beschreven. In hoofdstuk 2 geven we een protocol voor het labelen van amino-allyl thymidine-bevattende probes wet een gekozen Cy kleurstof. Een overzicht van de computationele stappen die nodig zijn om enkel mRNA plekken te identificeren is voorzien in paragraaf 7.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadyl Ribonucleoside Complex</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyticase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5263</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1010954001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03446l</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI, dilactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9564</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Shelton Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6001</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline-sodium citrate (SSC) 20X</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82021-484</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (deionized)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3155</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>150710</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysine (0.01%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Cs-18R15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probes</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Custom order for your desired mRNA sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 96-well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>265300</td>
			<td>Alternative to coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>monofunctional NHS-ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen I Cleaner</td>
			<td>Terra Universal</td>
			<td>9505-00</td>
			<td>Controller (Cat #9505-17 optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td>205SDMLAM</td>
			<td>For operating Plasma-Preen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-UB617R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>X-Cite</td>
			<td>XCT 10-A</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Sets</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD or EMCCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C4742-98-24ER</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of mrna molecules using fluorescence in situ hybridization in saccharomyces cerevisiae

De fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) werkwijze kan men nucleïnezuren te detecteren in de natieve cellulaire omgeving. Hier geven we een protocol voor het gebruik van FISH met het aantal van mRNA te kwantificeren in enkele gistcellen. Cellen kunnen worden gekweekt in een toestand van rente en daarna gefixeerd en maakte doorlaatbaar. Vervolgens worden meerdere enkelstrengs deoxyoligonucleotiden geconjugeerd met fluorescente kleurstoffen gebruikt voor het merken en zichtbaar mRNAs. Buigingsbegrensde fluorescentie uit een mRNA-moleculen wordt gekwantificeerd met behulp van een spot-algoritme het aantal mRNA per cel te identificeren en te tellen. Terwijl de meer standaard kwantificering van Northern blots, RT-PCR en genexpressie microarrays informatie gemiddeld mRNA in de massapopulatie, FISH maakt zowel het tellen en lokalisatie van deze mRNAs in enkelvoudige cellen bij single-molecule resolutie.

Figuur 3 toont typische histogrammen berekend uit FISH beeld en gebruikt om het aantal mRNAs aanwezig in enkele cellen te bepalen. Een belangrijk voordeel van microscopie-gebaseerde RNA kwantificering is dat informatie over de lokalisatie van de transcripten kan vinden. Zo gebruikten we FISH om mRNAs in enkelvoudige cellen te identificeren met een induceerbare CBF1 allel (Figuur 4). Omdat veel mRNA moleculen op de plaats van transcriptie zijn wij in staat om de aanwezigheid en locatie van transcriptie locaties binnen de kern te identificeren. Door gebruik van verschillende kleurstoffen label mRNAs van verschillende genen, kan men meerdere mRNA species kwantificeren in dezelfde cellen. Om dit te demonstreren, werden gistcellen geïncubeerd in aanwezigheid van α-factor en sorbitol. FUS1 transcriptie (Quasar670 kleurstof rood) wordt geïnduceerd door α-factor. STL1 transcriptie (Quasar 570 kleurstof, groen) wordt veroorzaakt door een toename in extracellulaire osmolariteit ( <strong&gt; Figuur 5). Figuur 4 is een voorbeeld van FISH met probes Singer. Figuur 5 is een voorbeeld van FISH met Stellaris probes. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische voorstelling van FISH experimentele procedure. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> Figuur 2. Schematische voorstelling van beeldanalyse pijplijn. De laatste plekken zijn bepaald in de meest rechtse figuur. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> Figuur 3. Histogram van spot intensiteiten voor een bepaald gen met behulp van Singer sondes </strong&gt;. Probe intensiteiten worden berekend zowel binnen (rood) en buiten (blauwe) cellen. Lage intensiteit plekken zijn ofwel ruis of enkele sondes. Real mRNA berichten worden gelabeld met meerdere sondes. Bij het gebruik van Stellaris sondes, enkele sondes zijn minder detecteerbaar en dus de drempels en filtering moeten dienovereenkomstig worden aangepast. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> Figuur 4. Representatieve resultaten van Singer FISH procedure. In dit experiment wordt CBF1 transcriptie geactiveerd met een induceerbare promoter 18. Kernen zijn blauw gekleurd met DAPI. CBF1 mRNA&#39;s zijn voorzien van tag met Cy3-gelabelde probes. Witte pijlen wijzen op de aanwezigheid van CBF1 transcriptie locaties in de kern. Enkel mRNA transcripten zichtbaar in het cytoplasma. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> Figuur 5. Representatieve resultaten van Stellaris FISH procedure. MATa gistcellen werden tegelijkertijd blootgesteld aan 30 ng / ml α-factor en 0,75 M sorbitol gedurende 10 min en werden gelijktijdig onderzocht voor FUS1 (Quasar 670, rood) en STL1 (Quasar 570, groen) transcripten. In het gemarkeerde vak, kunnen we zien een cel alleen reageert op de feromonen (FUS1 startsite, rood) en andere voornamelijk reageren op sorbitol (STL1 startsite, groen).

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het uitvoeren Fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) voor het tellen van mRNA&#39;s in enkele cellen in single-molecule resolutie.

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissectie van Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Fluorescentie In situ Hybridisatie (FISH) Protocol in menselijk sperma

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Detectie van virale RNA door fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Meting van mRNA Decay tarieven in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Het gebruik van<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Stammen

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie aan Geplette Chromosomen

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Snelle identificatie van chemische Genetische Interacties in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Cycloheximide Chase Analyse van de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...