Name: visualization and analysis of mrna molecules using fluorescence in situ hybridization in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2013-06-14T13:00:00
Duration: 7 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet med tilskudd GM046406 (til DB) og ved National Institute of General Medical Sciences Center for Kvantitativ biologi (GM071508). RSM erkjenner midler fra NSF Graduate Research Fellowship. MNM er støttet av en Lewis-Sigler Fellowship. Vi ønsker å takke medlemmene av Botstein lab for nyttige diskusjoner og tidligere medlemmer Allegra Petti og Nikolai Slavov for sine bidrag til den metabolske syklus prosjektet. Vi takker Daniel Zenklusen og Robert Singer for å få oss i gang med FISH-metoden.

Figurene 1 og 2 er skjematisk av fisken eksperimentelle prosedyrer og bildeanalyse rørledning brukt for å kvantifisere FISH bilder. En. Løsninger for å forberede * Løsningene nedenfor for bruk med Singer sonder. Hvis du bruker Stellaris sonder, erstatte &quot;40% formamid&quot; med &quot;10% formamid&quot; i både Hybridisering Buffer og Wash Buffer. Andre endringer i Hybridisering Buffer ved bruk av Stellaris prober er (1) tilsett 1 g dekstransulfat og (2) inkluderer ikke 10 mg ssDNA. Buffer B 8 ml 1 M KH 2 PO 4 41,5 ml 1M K 2 HPO 4 109,3 g Sorbitol Spheroplasting Buffer 890 mL buffer B 100 pl VRC 10 ul 25 000 E / ml Lyticase 2 ul β-merkaptoetanol &lt;sterk&gt; hybridiseringsbuffer (10 ml, endelig volum) 10 mg E. coli tRNA 10 mg ssDNA * 100 pl 200 mM VRC lager 40 ul av 50 mg / ml BSA 1 ml 20X SSC 4 ml 40% Formamide * Nuclease Free Water (til 10 ml endelig volum) 1 g dekstransulfat * * Hybridiseringsbuffer kan holdes i 0,5 ml alikvoter ved -20 ° C for enkelhets skyld. Vask Buffer (50 ml, endelig volum) 5 ml 20X SSC 20 ml 40% Formamide * Nuclease Free Water (til 50 ml endelig volum) Merking Buffer 1.06 g Sodium Carbonate 100 ml DEPC Water pH 9 2. Probe-merking (Singer prober Only) Vi får disse sondene ved in-house syntese ved hjelp av en ABI oligonukleotidsyntese apparat. Typically, er 4-5 ~ 50 bp oligonukleotider syntetisert som er homologe til genet av interesse, ved å erstatte amino-allyl-tymidin i flere thymidines fordeles på minst 8, fortrinnsvis 10 + bp fra hverandre. På grunn av deres følsomhet for ozon, jobber vi i en ozon-free-anlegget når du bruker CY fargestoffer. <ol><li> Skaff ~ 5 prober og resuspender i 100 mL vann - sjekk konsentrasjoner på NanoDrop. </li><li> Avhengig av hvor mange sonder / genet, kombinere totalt 10 mikrogram oligonukleotidene / genet (for eksempel hvis har fem sonder / genet, så vil 2 mikrogram / ​​probe). </li><li> Bruk QIAquick kolonner for å rense sonder ifølge QIAquick Nucleotide fjerning Kit Protocol. </li><li> Legg 10 volumer Buffer PN til totalt volum av kombinerte prober og bland. </li><li> Påfør prøven til QIAquick kolonne - hvis totale volumet er større enn 750 ul, spinner ned to ganger med halvparten av volumet i hvert spinn </li><li> La stå i 1 min. </li><li> Sentrifuger 1 min ved 6000 rpm. </li><li> Vask med 750 mL buffer PE. </li><li> Sentrifuger1 min ved 6000 rpm. </li><li> Kasser strømme gjennom og re-spinn kolonne i 1 min ved 13.000 rpm for å tørke. </li><li> Sted QIAquick kolonne i nytt mikrosentrifugerør og eluer DNA med 50 mL H 2 O - Sørg for H 2 O pH er innenfor 7.0 og 8.5 og er plassert direkte på membranen. </li><li> La stå i 1 min. </li><li> Sentrifuger i 1 minutt ved 13.000 rpm for å eluere DNA. </li><li> Lyophilize DNA ved 45 ° C. </li><li> Resuspender pellet i 10 mL merking buffer og legge til rør av fargestoff uten å berøre fargestoff. </li><li> Gjenta med en annen 10 ul merking buffer. </li><li> Vortex og spinne ned rør av fargestoff og DNA. </li><li> Dekk rørene med aluminiumsfolie og oppbevar i mørke ved RT O / N å merke. </li><li> Gjenta QIAquick Nucleotide fjerning Kit Protocol. Utføre med to forskjeller: - Tilsett 200 mL PN buffer til prober og sette merkede prober gjennom kolonner 2x. - Utfør 3 vasker med buffer PE for å vaske bort noen løse fargestoff før eluering. </li><li> After eluering skaffe konsentrasjon via NanoDrop. Merkingen effektivitet er vanligvis ~ 0,25 pmol / ng av enkelttrådet DNA. </li></ol> 3. Coverslip Forberedelse <ol><li> Plasser Dekkglass på lysbilder i Plasma-preen vakuum kammer ( <a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a> ) (jo nærmere sentrum jo bedre). </li><li> Sett vakuum kammer i mikrobølgeovn, og kontroller at den er forseglet. </li><li> Slå på pumpen først slå deretter på vakuum bare når pumpen er i gang. </li><li> Slå på mikrobølgeovn, og stoppe 5 sek etter at plasma er synlig. </li><li> Slå av vakuum og deretter pumpe. </li><li> Trekk ut vakuum kammer og fjerne Dekkglass med tang (de som har falt må rengjøres igjen). </li><li> Sted Dekkglass renset siden opp i 12-brønners plater. </li></ol> 4. Fiksering Prosedyre <ol><li> Grow gjær til en OD 600 på rundt 0,1-0,2 i minimale media. 10 ml av cellene gir nok for ~ 10 separate hybridizations. </li><li> Legg 1/10 volum 37% formaldehyd direkte til vekstmediet (10 ml av kulturen + 1 ml 37% formaldehyd) og la det stå i 45 min. </li><li> Vask 2 ganger med 1 ml iskald buffer B i et mikrosentrifugerør (kan rotere ved 13.000 opm i 1 min). </li><li> Tilsett 1 ml av spheroplasting buffer. </li><li> Inkuber ved 37 ° C i 15 min. Sjekk celler hver noen minutter under mikroskop før de fleste cellene er svarte (dvs. ikke fase-lys). </li><li> Vask 2x med iskald Buffer B, spinning på lav hastighet (~ 3500 rpm). </li><li> Tilsett 1 ml 70% EtOH, resuspender forsiktig og la over natten ved 4 ° C (kan lagres på ubestemt tid ved -20 ° C). </li></ol> 5. Hybridisering Prosedyre <ol><li> Forbered hybridiseringsoppløsningen: til 100 mL av hybridiseringsbuffer, tilsett 1-3 ul av probe, deretter vortex og sentrifuge. Singer sonder bruker 8-10 ng totalt per probe sett (dvs. per genet). Vi har fotografert opptil tre gener samtidig med tre forskjellige merket probe setter. </li></ol> Pass på å varme opp hybridisering løsningen til romtemperatur før du åpner den. For Stellaris sonder, anbefales det å starte fire separate hybridiseringsreaksjoner ved å legge en ul hver på 1:10, 1:20, 1:50 og 1:100 arbeider fortynninger av sonder for å se hvilken som er optimal. Working fortynninger av Stellaris prober er utarbeidet i Hybridisering buffer. <ol start="2"><li> Sentrifuge (for alle etterfølgende trinn, 3500 rpm, 5 min) de faste celler (f.eks 200 pl) og aspirere bort etanol. </li><li> Forsiktig resuspender i 1 ml vaskebuffer som inneholder den samme prosentandel formamid som hybridiserings-buffer. La stå i 2-5 min. </li><li> Sentrifuger prøven og aspirer vask buffer, deretter legge hybridisering løsning. Inkuber i mørke med forsiktig rysting, O / N ved 37 ° C. </li></ol> Merk: Følgende prosedyre gjelder søker / bildebehandling celler på dekkglass. For wForaskning / bildebehandling celler i 96-brønners plater, inkludert alternative reaktive oksygen arter gatefeier løsning se <a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.</a> <ol start="5"><li> Den neste dag, eller på forhånd, ren (se prosedyre) og behandle dekkglass med 150 pl 0,01% Poly-L-lysin i 5 min. Sug, la tørke, vaske 3x med dH 2 O og la tørke. </li><li> Om morgenen, tilsett 1 ml vaskebuffer til prøven, forsiktig resuspender, sentrifuge og aspireres, deretter resuspender i ytterligere 1 ml vaskebuffer og inkuberes ved 37 ° C i 30 min. </li><li> Vask med 2X SSC + 0,1% Triton X-100 ved romtemperatur i 15 min-rister. </li><li> Ta montering medium ut av fryseren for å la den komme opp til RT før montering. </li><li> Vask med 1X SSC på RT 15 min på shaker. </li><li> Fortynne DAPI inn PBS (0,1 mikrogram / ml final) og Resuspender celler i 150 mL. </li><li> Sted løsning på renset / poly-lys-treated dekkglass i 12-brønners plate, minst 30 min uforstyrret. </li><li> Fjern løsning (du kan plassere den på et ekstra dekkglass som en sikkerhetskopi) og vask 3x med 1 ml 1X PBS. </li><li> Plasser tre ul forlenge Gold montering medium på et lysbilde (Invitrogen P36934). Gjør dette en om gangen hvis du har flere dekkglass for å unngå uttørking av montering medium. </li><li> Legg ~ 0,5 ml etanol til dekkglass i 12-brønners plate, ta av dekselet slip og lufttørke mens du holder med pinsett. </li><li> Plasser dekke slip celle-side ned på montering medium og la stivne flere timer eller O / N i mørket. </li><li> Forsegle kantene med neglelakk og fortsett til bildebehandling. </li></ol> 6. Imaging Celler med Olympus IX-81 Inverted Microscope Oversikt <ol><li> For bildeinnlastingen bruker vi Slidebook (intelligent-imaging.com) programvare og en 100X, 1,45 NA, TIRFM olje objektiv. For seriell GFP, DAPI, Cy3, Cy3.5 og Cy5 bildebehandling: Chroma filter sett (se reagenser). </li><li> Bruk DAPI filterå finne og fokusere celler. </li><li> Sett dette som referansepunkt. </li><li> Ta en z-stack av bilder rundt referansepunkt der den totale distansen er 5 mikrometer med 0,2 mikrometer størrelse (25 fly). Gjenta for hver farge kanal (dvs. hver sonde sett). </li><li> Eksporterer som et 16-bits TIFF for bildeanalyse. </li></ol> 7. Bildeanalyse Oversikt (Singer prober) Nedenfor gir vi en oversikt over beregningsmetoder vi bruker for å analysere FISK bilder i MATLAB. De relevante MATLAB funksjoner som brukes er klammen på høyre side. Algoritmer og terskler er nå innstilt for data fra Singer stil sonder. Ved hjelp av Stellaris stil sonder vil kreve litt justering, særlig til den endelige filtrering trinn (7,8). Cell Identification 15 <ol><li> Separate celler fra bakgrunnen med en global terskel på DAPI bilder 16 [graythresh]. </li><li> Identifiser kjerner bruker utvidet maxima funksjon [imextendedmax]. </li><li> Segment celler ved hjelp av kjerner som frø for et vannskille algoritme [vannskille]. </li></ol> Finn flekker i hvert fluorescens kanal <ol start="4"><li> Utfør topphatt transformasjon å normalisere bakgrunn og forbedre signal til støyforhold [bwmorph]. </li><li> Finn maxima å identifisere i fokus lag (i z-planet) for hver spot [imregionalmax]. </li><li> Filter potensielle flekker ved hjelp av en lineær modell for å passe en radial gradient. </li></ol> Mål sted intensitet og filter singel vs multiple probe signaler <ol start="7"><li> Monter en 2D Gaussian profil til stedet i tidligere identifisert i fokus lag og anslag intensitet 17. </li><li> Filtrere ut svake punkter ved hjelp av en terskel (basert på histogram). For Singer typen sonder dette er viktig, men er mindre så for Stellaris sonder. </li><li> Telle flekker i hver celle. </li></ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li><li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+Detection+of+Rna-DNA+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations.">Formation and Detection of Rna-DNA Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 63, 378 (1969).</li><li>Jones, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+and+Nuclear+Location+of+Mouse+Satellite+DNA+in+Individual+Cells.">Chromosomal and Nuclear Location of Mouse Satellite DNA in Individual Cells.</a> Nature. 225, 912 (1970).</li><li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA.">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li><li>Singer, R. H., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+gene+expression+visualized+in+chicken+muscle+tissue+culture+by+using+in+situ+hybridization+with+a+biotinated+nucleotide+analog.">Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7331-7335 (1982).</li><li>Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+cycling+in+single+yeast+cells+from+unsynchronized+steady-state+populations+limited+on+glucose+or+phosphate.">Metabolic cycling in single yeast cells from unsynchronized steady-state populations limited on glucose or phosphate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6946-6951 (2010).</li><li>Trcek, T., Larson, D. R., Moldon, A., Query, C. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mRNA+decay+measurements+reveal+promoter-+regulated+mRNA+stability+in+yeast.">Single-molecule mRNA decay measurements reveal promoter- regulated mRNA stability in yeast.</a> Cell. 147, 1484-1497 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li><li>Gandhi, S. J., Zenklusen, D., Lionnet, T., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+functionally+related+constitutive+genes+is+not+coordinated.">Transcription of functionally related constitutive genes is not coordinated.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 27-34 (2011).</li><li>Itzkovitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+transcript+counting+of+stem-cell+markers+in+the+mouse+intestine.">Single-molecule transcript counting of stem-cell markers in the mouse intestine.</a> Nature Cell Biology. 14, 106-U193 (2012).</li><li>Raj, A., Rifkin, S. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+gene+expression+underlies+incomplete+penetrance.">Variability in gene expression underlies incomplete penetrance.</a> Nature. 463, 913-U984 (2010).</li><li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes.">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472 (10), 365-386 (2010).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).</li><li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tlreshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Tlreshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li><li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22, 4447-4459 (2011).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9, 743-U159 (2012).</li><li>Levsky, J. M., Shenoy, S. M., Pezo, R. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+profiling.">Single-cell gene expression profiling.</a> Science. 297, 836-840 (2002).</li><li>Wyart, M., Botstein, D., Wingreen, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Gene+Expression+Dynamics+Using+Pairwise+RNA+FISH+Data.">Evaluating Gene Expression Dynamics Using Pairwise RNA FISH Data.</a> Plos Computational Biology. 6, (2010).</li></ol>

Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Til dags dato har FISH primært vært en lav-throughput metode. Bruken av Cy3, Cy3.5, og Cy5 fargestoffer begrenser antall gener kan man undersøke i enkeltceller til tre på en gang. Noen ytterligere sonder har blitt utviklet (Stellaris), men antallet kan skjelnes prober er likevel høyst syv. For å omgå denne begrensningen, har kombinatoriske merking strategier bruker flere fluorophores blitt brukt til å lage strekkoder for ulike mRNA arter 19,20. Nå nylig, brukte Lübeck og Cai optisk og spektral barcoding å kvantifisere 32 forskjellige arter samtidig med FISH i enkle gjærceller 19. En begrensning av denne siste kombinatorisk tilnærming er det krever bruk av super-oppløsning mikroskopi. Analysen nødvendig for å skille de strekkode prober er også ganske komplisert. Vi har funnet ut at Cy3 og Cy3.5 er å foretrekke fremfor Cy5 for FISH eksperimenter. En av begrensningene til Cy5 fargestoff er dens følsomhettil photobleaching. Imidlertid har Stellaris nylig utviklet Cy5 varianter som er annonsert som mer motstandsdyktig mot photobleaching, og kan lindre dette tekniske problemet. Det er også verdt å merke seg at fisk er en kostbar metode for å implementere og at både sanger og Stellaris sonder vanligvis koster $ 700 - $ 1000 per probe sett, selv om prisene for kommersielt tilgjengelige sonder bør reduseres i fremtiden. Sparsom av reagenser og effektiv merking bringer Singer sonder ned til nedre varierer i pris. En av de store tekniske utfordringer er separasjon av enkelt-versus multippel probe flekker, noe som krever gjennomføring av sofistikerte flekk-hetsbestemmende algoritmer. Dette kan ta omfattende manuell gjennomgang for å tune bildeanalyse parametere for bestemte eksperimentelle oppsett. Et omriss av vår beregningsorientert rørledning med relevante MATLAB funksjoner er gitt i § 7 i protokollen. Dette problemet er noe mildnet av de Stellaris sonder som har bare<html> én etikett per probe. Det krever derfor colocalization av flere sonder for å se et signal. Fordi FISH nødvendiggjør fikse celler, betyr det ikke lette sporing individuelle celler over tid. Tidligere brukte vi FISK snapshot data for å rekonstruere dynamikken i genuttrykk i enkelte metabolsk sykling gjær bestander seks. Metabolsk sykling er observert i pre-sultet, kontinuerlige kulturer, og er preget av befolkningen brede kollektive svingninger i oksygenforbruk. Disse svingninger er forbundet med genom-vide svingninger av transkripter som oppstår for halvparten av all gjær gener i ulike faser av oksygenforbruk. Vi ønsket å finne ut om metabolsk sykle var til stede i usynkroniserte kontinuerlige gjær kulturer. Hvis den finnes, bør karakterutskrifter som er anti-korrelert i synkrone befolkninger også være anti-korrelert i usynkroniserte enkeltceller, og vice versa for korrelerte transkripsjoner. ent &quot;&gt; å rekonstruere dynamikk av mRNA produksjon i tid, må de observerte data snapshot sammenliknes med det som er forventet fra en modell av det underliggende oppførsel. Det er teoretiske begrensninger når slike&quot; snapshot &quot;av genekspresjon dataene kan brukes til å bestemme de underliggende genuttrykk dynamikk og hvilke typer modeller kan skilles 21. For de metabolske syklus data, snarere enn direkte viser tilstedeværelse av tidsmessige svingninger, ble statistiske målinger gjennomført for å underbygge at det er faktisk en celle autonom oscillasjon program forenlig med bulk microarray målinger.

Ved hjelp av bulk måleteknikker, er det ikke mulig å analysere antallet transkripter eller transkripsjonelle aktivitet innen enkeltceller en. Ved hjelp av fluoriserende proteiner drevet av arrangører av interesse som journalister av genuttrykk kan løse dette problemet til en viss grad, men den tiden som kreves for fluorescerende proteiner for å kaste tilslører tidlig dynamikk. Langlivede fluorescerende proteiner kan heller ikke rapportere mRNA levetid. FISH metode kan anvendes for å bestemme mRNA under sin livssyklus, fra transkripsjons-initierings i kjernen til påfølgende modning og forråtnelse i enkle celler, med enkelt-molekyl oppløsning. Den opprinnelige in situ eksperimenter for å visualisere nukleinsyrer brukt radiomerket RNA prober å sondere DNA-elementer. Disse inkluderte visualisere ribosomal DNA i eggstokkene av frosken Xenopus laevis 2 og satellitt DNA i mus vev tre. Den første fluorescerende in situ kompetanseiment brukt et RNA molekyl som er merket med en fluorofor å sondere bestemte DNA-sekvenser fire. Den første søknaden av fluorescerende prober for å visualisere RNA in situ var visualisering av aktin genuttrykk i kylling muskelvev kultur fem. Mer nylig, i spirende gjær, har fisken har vært brukt til å undersøke oscillasjoner i transkripsjon under gjær metabolske syklus 6, nedbrytning av mRNA under cellesyklusprogresjon 7, og romlig lokalisering av mRNA transkripter i løpet av mitose 8.. FISH har vært brukt i gjær å vise at ukorrelerte svingninger i constitutively transkriberte gener, som utgjør mer enn halvparten av alle gjær gener, oppstår fra uncorrelated transkripsjon initiering ni. I ikke-gjær arter, har FISH blitt brukt til å identifisere stamcelletransplantasjon markører i musen tarmen 10 og for å fastslå at ufullstendig penetrans av celle skjebner kan skyldes stokastiske genuttrykk svingninger i C.elegans embryoer 11. FISH metoden beskrevet her fungerer ved hybridizing dye-merket, single-strandet DNA prober til mRNA meldinger. Celler er avbildes og mRNA tellet ved bruk av en flekk-oppdage algoritme. Single-strandet prober kan genereres med en DNA synthesizer og deretter merket (her kalt Singer prober) eller bestilles kommersielt som pre-merkede prober (Stellaris prober) 12,13. En stor forskjell mellom Singer og Stellaris sonder er at Singer sonder er lengre (~ 50 bp) og er multi-merket mens Stellaris sonder er korte (~ 20 bp) med bare én etikett per probe, som beskrevet av Raj et al 14. I tillegg benytter den Stellaris tilnærming mange flere prober pr gen enn det tilsvarende Singer (~ 30 mot 5 prober pr gen, henholdsvis). Nedenfor gis en protokoll som beskriver bruken av enten type sonde. I kapittel 2 gir vi en protokoll for merking av amino-allyl thymidine som inneholder prober wed en valgt Cy fargestoff. En oversikt over de beregningsorientert skritt som kreves for å identifisere enslige mRNA flekker er gitt i § 7.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadyl Ribonucleoside Complex</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyticase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5263</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1010954001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03446l</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI, dilactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9564</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Shelton Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6001</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline-sodium citrate (SSC) 20X</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82021-484</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (deionized)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3155</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>150710</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysine (0.01%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Cs-18R15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probes</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Custom order for your desired mRNA sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 96-well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>265300</td>
			<td>Alternative to coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>monofunctional NHS-ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen I Cleaner</td>
			<td>Terra Universal</td>
			<td>9505-00</td>
			<td>Controller (Cat #9505-17 optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td>205SDMLAM</td>
			<td>For operating Plasma-Preen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-UB617R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>X-Cite</td>
			<td>XCT 10-A</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Sets</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD or EMCCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C4742-98-24ER</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of mrna molecules using fluorescence in situ hybridization in saccharomyces cerevisiae

Fluorescens in situ hybridisering (FISH)-metoden gjør det mulig å detektere nukleinsyrer i den innfødte cellulære miljø. Her gir vi en protokoll for bruk av FISH å tallfeste antall mRNA i enkle gjærceller. Cellene kan dyrkes i en hvilken som helst tilstand av interesse og deretter fiksert og gjort gjennomtrengelig. Deretter er flere single-strandet deoxyoligonucleotides konjugert til fluorescerende fargestoffer brukes til å merke og visualisere mRNA. Diffraksjon-begrenset fluorescens fra enkelt mRNA molekyler kvantifiseres ved hjelp av en spot-algoritme for å identifisere og telle antall mRNA per celle. Mens de mer vanlige kvantifisering metoder for nordlige blotter, RT-PCR og genuttrykk microarrays gir informasjon om gjennomsnittlig mRNA i bulk befolkningen, letter FISH både telling og lokalisering av disse mRNA i enkeltceller på enkelt-molekyl oppløsning.

Fig. 3 viser typiske histogrammer beregnet fra fisk bilder, og brukes til å bestemme antall mRNA tilstede i enkle celler. En viktig fordel med mikroskopi-basert RNA kvantifisering er at man kan få informasjon om lokalisering av transkripsjoner. For eksempel brukte vi FISH å identifisere mRNA i enkeltceller med en induserbar CBF1 allel (figur 4). Fordi mange mRNA molekyler er til stede på stedet av transkripsjon, er vi i stand til å identifisere tilstedeværelsen og beliggenheten av transkripsjon områder innen kjernen. Ved å benytte forskjellige fargestoffer for å label mRNA&#39;er av forskjellige gener, kan man kvantifisere flere mRNA-arter i de samme cellene. For å demonstrere dette ble gjærceller inkubert i nærvær av α-faktor og sorbitol. FUS1 transkripsjon (Quasar670 fargestoff, rødt) er indusert av α-faktor. STL1 transkripsjon (Quasar 570 fargestoff, grønn) er forårsaket av økning i ekstracellulær osmolaritet ( <strong&gt; figur 5). Figur 4 er et eksempel på FISH med sangeren sonder. Figur 5 er et eksempel på FISH med Stellaris sonder. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> Figur 1. Skjematisk av FISH eksperimentell prosedyre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> Figur 2. Skjematisk av bildeanalyse rørledning. De siste plassene er bestemt i lengst til høyre figur. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> Figur 3. Histogram av spot intensiteter for et bestemt gen ved hjelp Singer sonder </strong&gt;. Probe intensiteter er beregnet både på innsiden (rød) og utenfor (blå) celler. Lav intensitet flekker er enten støy eller enslige sonder. Ekte mRNA meldinger merket med flere sonder. Ved bruk av Stellaris sonder, enslige sonder er mindre synlig og dermed terskler og filtrering må justeres tilsvarende. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> Figur 4. Representative resultatene av Singer FISH prosedyre. I dette forsøket er CBF1 transkripsjon aktivert med en induserbar promoter 18.. Atomkjerner er farget blå med DAPI. CBF1 mRNA er merket med Cy3-merkede prober. Hvite piler markere tilstedeværelsen av CBF1 transkripsjon steder i kjernen. Enkelt mRNA transkripsjoner er synlige i cytoplasma. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> Figur 5. Representative resultatene av Stellaris FISH prosedyre. Mata gjærceller ble samtidig utsatt til 30 ng / ml α-faktor og 0,75 M sorbitol i 10 min og ble samtidig undersøkt for FUS1 (Quasar 670, rød) og STL1 (Quasar 570, grønn) transkripsjoner. I den merkede boksen, kan vi se en celle reagerer bare til feromon (FUS1 startwebstedet, rød) og en annen overveiende reagerer på sorbitol (STL1 startwebstedet, grønn).

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Denne protokollen beskriver en eksperimentell prosedyre for å utføre Fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH) for telling mRNA i enkeltceller på enkelt-molekyl oppløsning.

Visualisering og analyse av mRNA molekyler med fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Påvisning av virale RNA ved fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Sammen Analyser for Monitoring Protein Refolding i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Måling av mRNA Decay priser i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Bruke<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Stammer

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...