Name: visualization and analysis of mrna molecules using fluorescence in situ hybridization in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2013-06-14T13:00:00
Duration: 7 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Denna forskning har finansierats med bidrag GM046406 (DB) och National Institute of General Medical Sciences Center for Quantitative Biology (GM071508). RSM erkänner finansiering från NSF Graduate Research Fellowship. MNM stöds av en Lewis-Sigler Fellowship. Vi vill tacka medlemmarna i Botstein labbet för bra diskussioner och tidigare medlemmar Allegra Petti och Nikolai Slavov för deras bidrag till den metaboliska cykeln projektet. Vi tackar Daniel Zenklusen och Robert Singer för att få oss började med FISH-metoden.

Figurerna 1 och 2 är schematiska i förfaranden FISH experimentella och bildanalys rörledning används för att kvantifiera FISH bilder. Ett. Lösningar för att förbereda * Lösningarna nedan gäller för användning med Singer sonder. Om du använder Stellaris sönder, byt ut &quot;40% formamid&quot; med &quot;10% formamid&quot; i både Hybridiseringsbuffert och Wash Buffer. Ytterligare förändringar Hybridiseringsbuffert vid användning Stellaris sonder är (1) tillsätt 1 g dextransulfat och (2) inte omfattar 10 mg ssDNA. Buffert B 8 ml 1 M KH 2 PO 4 41,5 ml 1M K 2 HPO 4 109,3 g Sorbitol Spheroplasting Buffert 890 l buffert B 100 ^ VRC 10 pl 25.000 U / ml Lyticase 2 | il β-merkaptoetanol &lt;strong&gt; Hybridiseringsbuffert (10 ml, slutlig volym) 10 mg E. coli tRNA 10 mg ssDNA * 100 | il 200 mM VRC lager 40 pl av 50 mg / ml BSA 1 ml 20X SSC 4 ml 40% Formamid * Sterilt vatten (10 ml slutlig volym) 1 g dextransulfat * * Hybridiseringsbuffert får förvaras i 0,5 ml alikvoter vid -20 ° C för bekvämlighet. Tvättbuffert (50 ml, slutlig volym) 5 ml 20X SSC 20 ml 40% Formamid * Sterilt vatten (50 ml slutlig volym) Märkning Buffert 1,06 g natriumkarbonat 100 ml DEPC Vatten pH 9 2. Probe-märkning (Singer prober Only) Vi får dessa sönder genom in-house-syntes med en ABI apparat oligonukleotidsyntes. Typicbundsförvant, är 4-5 ~ 50 bp oligonukleotider som är homolog med den intressanta genen, ersatte amino-allyl tymidin flera tymidiner åtskilda minst 8, företrädesvis 10 + bp isär. På grund av deras känslighet för ozon, arbetar vi i en ozon-fri anläggning vid användning CY färgämnen. <ol><li> Skaffa ~ 5 sonder och återsuspendera i 100 pl vatten - check koncentrationer på Nanodrop. </li><li> Beroende på hur många sonder / Gene, kombinera sammanlagt 10 mikrogram oligonukleotider / gen (t.ex. om har 5 sonder / gen, sedan vill 2 mikrogram / ​​sond). </li><li> Använd QIAquick kolumner att rena prober enligt QIAquick Nucleotide Removal Kit Protocol. </li><li> Lägg 10 volymer Buffert PN till totala volymen av kombinerade sonder och blanda. </li><li> Applicera provet QIAquick kolumn - om total volym är större än 750 l, spinn ner två gånger med hälften av volymen i varje dragning </li><li> Låt stå i 1 min. </li><li> Centrifugera 1 min vid 6000 rpm. </li><li> Tvätta med 750 l buffert PE. </li><li> Centrifugera1 min vid 6000 rpm. </li><li> Kassera flödet genom och re-spinnkolonn under 1 min vid 13.000 varv per minut för att torka. </li><li> Placera QIAquick kolumn i nya mikrocentrifugrör och eluera DNA med 50 pl H2O - Kontrollera H2O pH är inom 7,0 och 8,5 och placeras direkt på membranet. </li><li> Låt stå i 1 min. </li><li> Centrifugera under 1 min vid 13.000 varv per minut för att eluera DNA. </li><li> Lyofilisera DNA vid 45 ° C. </li><li> Återsuspendera pelleten i 10 pl märkning buffert och lägg till röret av färgämne utan att vidröra färgämnet. </li><li> Upprepa med ytterligare 10 pl märkning buffert. </li><li> Vortex och spinn ner röret av färgämne och DNA. </li><li> Täck rören med aluminiumfolie och förvara i mörker vid RT O / N för att märka. </li><li> Upprepa QIAquick Nukleotid Protocol Removal Kit. Utför med två skillnader: - Tillsätt 200 l PN buffert till prober och sätta märkta prober genom kolonner 2x. - Utför 3 tvättar med buffert PE i syfte att tvätta bort all lös färg innan eluering. </li><li> After eluering erhålla koncentration via NanoDrop. Den märkningseffektiviteten är typiskt ~ 0,25 pmol / ng av enkelsträngat DNA. </li></ol> Tre. Täckglas Framställning <ol><li> Placera täckglas på objektglasen i Plasma-preen vakuumkammare ( <a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a> ) (den närmare centrum desto bättre). </li><li> Sätt vakuumkammare i mikrovågsugn och se till att den är förseglad. </li><li> Slå på pumpen först och sedan slå på vakuum bara en gång pumpen startas. </li><li> Slå på mikrovågsteknik, och stannar 5 sekunder efter att plasma är synlig. </li><li> Stäng av vakuum sedan pumpa. </li><li> Dra ut vakuumkammaren och ta bort täckglas med pincett (de som har fallit måste rengöras igen). </li><li> Place täckglas rengöras sida upp i 12-brunnsplattor. </li></ol> 4. Fixering Procedur <ol><li> Grow jäst till en OD 600 av omkring 0,1 till 0,2 i minimalt medium. 10 ml celler ger tillräckligt for ~ 10 separata hybridiseringarna. </li><li> Tillsätt 1/10 volym 37% formaldehyd direkt till tillväxtmediet (10 ml kultur + 1 ml 37% formaldehyd) och låt stå i 45 min. </li><li> Tvätta 2x med 1 ml iskall buffert B i ett mikrocentrifugrör (kan snurra vid 13000 rpm i 1 min). </li><li> Tillsätt 1 ml spheroplasting buffert. </li><li> Inkubera vid 37 ° C under 15 min. Kontrollera celler med några minuter under mikroskop tills de flesta celler är svarta (dvs. inte fas-ljus). </li><li> Tvätta 2x med iskall Buffert B, spinning vid låg hastighet (~ 3500 rpm). </li><li> Tillsätt 1 ml 70% EtOH, resuspendera försiktigt och lämna över natten vid 4 ° C (kan lagra obegränsad tid vid -20 ° C). </li></ol> Fem. Hybridisering Procedur <ol><li> Förbered hybridisering lösning: till 100 l av hybridisering buffert, tillsätt 1-3 il sond, då virvel och centrifugera. Singer prober använder 8-10 ng totalt per probe set (dvs. per gen). Vi har avbildat upp till 3 gener samtidigt med 3 DIFlunda märkt prob härdar. </li></ol> Var noga med att värma hybridiseringslösningen till rumstemperatur innan den öppnas. För Stellaris sonder rekommenderas att starta 4 separata hybridiseringsreaktioner genom att tillsätta 1 l vardera av 1:10, 1:20, 1:50 och 1:100 arbetsdagar utspädningar av prober för att se vilket som är optimalt. Arbeta utspädningar av Stellaris prober framställs i hybridisering buffert. <ol start="2"><li> Centrifug (för alla efterföljande steg, 3.500 rpm, 5 min) de fixerade cellerna (t.ex. 200 l) och aspirera bort etanolen. </li><li> Försiktigt återsuspendera i 1 ml tvättbuffert som innehåller samma procentsats formamid som hybridiseringsbufferten. Låt stå i 2-5 minuter. </li><li> Centrifugera provet och aspirera tvätt buffert, tillsätt sedan hybridisering lösning. Inkubera i mörker under försiktig skakning, O / N vid 37 ° C. </li></ol> Obs: Följande procedur gäller för tillämpning / avbildning celler på täckglas. För wföraskningen / avbilda celler i 96-brunnars plattor, inklusive alternativa reaktiva syreradikaler renhållare lösning se <a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.</a> <ol start="5"><li> Nästa dag, eller i förväg, ren (se förfarande) och behandla täckglas med 150 | il 0,01% Poly-L-lysin under 5 min. Sug, låt torka, tvätta 3x med dH 2 O och låt torka. </li><li> På morgonen, tillsätt 1 ml av tvätt buffert till provet, försiktigt resuspendera, centrifug och aspirera, sedan återsuspendera i ytterligare 1 ml av tvätt buffert och inkubera vid 37 ° C i 30 min. </li><li> Tvätta med 2X SSC + 0,1% Triton X-100 vid RT 15 min på skak. </li><li> Ta montering mediet ur frysen så att den kan komma upp till RT före montering. </li><li> Tvätta med 1 x SSC vid RT 15 min på skak. </li><li> Späd DAPI i PBS (0,1 ng / ml slutlig) och suspendera cellerna i 150 pl. </li><li> Placera lösningen på rengjorda / poly-lys-treated täckglas i 12-brunnars platta, minst 30 min ostört. </li><li> Ta lösning (du kan placera den på en ledig täckremsa som backup) och tvätta 3x med 1 ml 1X PBS. </li><li> Placera 3 pl Förläng Guld monteringsmedium på en bild (Invitrogen P36934). Gör detta på en gång om du har flera täckglas för att undvika uttorkning av montage mediet. </li><li> Lägg ~ 0,5 ml etanol till täckglas i 12-brunnar, ta bort täckglas och lufttorka medan du håller med pincett. </li><li> Placera täckglas cell-sidan nedåt på monteringsmedium och låt härda flera timmar eller O / N i mörker. </li><li> Täta kanterna med nagellack och fortsätt till bildbehandling. </li></ol> 6. Imaging av celler med Olympus IX-81 inverterat mikroskop Översikt <ol><li> För bildtagning vi använder Slidebook (intelligent-imaging.com) mjukvara och en 100X, 1,45 NA, TIRFM olja mål. För seriell GFP, DAPI, Cy3, Cy3.5 och Cy5 imaging: Chroma filtersatser (se reagenser). </li><li> Använd DAPI filteratt hitta och fokusera celler. </li><li> Ställ in detta som referenspunkt. </li><li> Ta en z-stack bilder runt referenspunkten om den totala sträckan är 5 ^ M med 0,2 iM storlek (25 plan). Upprepa för varje färg-kanal (dvs. varje sond set). </li><li> Exportera som en 16-bitars TIFF för bildanalys. </li></ol> 7. Bildanalys Översikt (Singer sonder) Nedan ger vi en översikt av computational metoder vi använder för att analysera FISH bilder i MATLAB. De relevanta MATLAB används funktioner parantes till höger. De algoritmer och trösklar är inställda för data från sonder Singer stil. Använda sonder Stellaris stil kommer att kräva en viss anpassning, särskilt till den slutliga filtreringen steg (7,8). Cellidentifiering 15 <ol><li> Separata celler från bakgrunden med hjälp av en global tröskel på DAPI bilder 16 [graythresh]. </li><li> Identifiera kärnor med utökad maxima funktionen [imextendedmax]. </li><li> Segment celler med kärnor som frön för en vattendelare algoritm [vattendelare]. </li></ol> Hitta platser i varje fluorescenskanal <ol start="4"><li> Utför tophat transformation att normalisera bakgrunden och förbättra signal-brus-förhållande [bwmorph]. </li><li> Hitta maxima för att identifiera i-fokus skikt (i z-planet) för varje punkt [imregionalmax]. </li><li> Filtrera potentiella fläckar med en linjär passform modell för en radiell övertoning. </li></ol> Mät spot intensitet och filter enstaka kontra multipla signaler sond <ol start="7"><li> Montera en 2D gaussprofil till platsen i tidigare identifierats i-fokus skikt och uppskattning intensitet 17. </li><li> Filtrera ut svaga punkter med hjälp av ett tröskelvärde (baserat på histogram). För prober Singer typ detta är viktigt, men är mindre för Stellaris sonder. </li><li> Räkna fläckar i varje cell. </li></ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li><li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+Detection+of+Rna-DNA+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations.">Formation and Detection of Rna-DNA Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 63, 378 (1969).</li><li>Jones, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+and+Nuclear+Location+of+Mouse+Satellite+DNA+in+Individual+Cells.">Chromosomal and Nuclear Location of Mouse Satellite DNA in Individual Cells.</a> Nature. 225, 912 (1970).</li><li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA.">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li><li>Singer, R. H., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+gene+expression+visualized+in+chicken+muscle+tissue+culture+by+using+in+situ+hybridization+with+a+biotinated+nucleotide+analog.">Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7331-7335 (1982).</li><li>Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+cycling+in+single+yeast+cells+from+unsynchronized+steady-state+populations+limited+on+glucose+or+phosphate.">Metabolic cycling in single yeast cells from unsynchronized steady-state populations limited on glucose or phosphate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6946-6951 (2010).</li><li>Trcek, T., Larson, D. R., Moldon, A., Query, C. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mRNA+decay+measurements+reveal+promoter-+regulated+mRNA+stability+in+yeast.">Single-molecule mRNA decay measurements reveal promoter- regulated mRNA stability in yeast.</a> Cell. 147, 1484-1497 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li><li>Gandhi, S. J., Zenklusen, D., Lionnet, T., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+functionally+related+constitutive+genes+is+not+coordinated.">Transcription of functionally related constitutive genes is not coordinated.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 27-34 (2011).</li><li>Itzkovitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+transcript+counting+of+stem-cell+markers+in+the+mouse+intestine.">Single-molecule transcript counting of stem-cell markers in the mouse intestine.</a> Nature Cell Biology. 14, 106-U193 (2012).</li><li>Raj, A., Rifkin, S. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+gene+expression+underlies+incomplete+penetrance.">Variability in gene expression underlies incomplete penetrance.</a> Nature. 463, 913-U984 (2010).</li><li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes.">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472 (10), 365-386 (2010).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).</li><li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tlreshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Tlreshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li><li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22, 4447-4459 (2011).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9, 743-U159 (2012).</li><li>Levsky, J. M., Shenoy, S. M., Pezo, R. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+profiling.">Single-cell gene expression profiling.</a> Science. 297, 836-840 (2002).</li><li>Wyart, M., Botstein, D., Wingreen, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Gene+Expression+Dynamics+Using+Pairwise+RNA+FISH+Data.">Evaluating Gene Expression Dynamics Using Pairwise RNA FISH Data.</a> Plos Computational Biology. 6, (2010).</li></ol>

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Hittills har FISH främst varit en låg genomströmning. Användningen av Cy3, Cy3.5 och Cy5 färgämnen begränsar antalet gener man kan undersöka i enstaka celler till tre åt gången. Några ytterligare prober har utvecklats (Stellaris) men antalet urskiljbara prober är fortfarande högst sju. För att kringgå denna begränsning, har kombinatoriska märkning strategier med hjälp av multipla fluoroforer använts för att skapa streckkoder för olika mRNA 19,20. Senast använde Lubeck och Cai optisk och spektrala barcoding att kvantifiera 32 olika arter samtidigt med fisk i enstaka jästceller 19. En begränsning med denna senaste kombinatoriska tillvägagångssättet är det kräver användning av super-resolution mikroskopi. Den analys som krävs för att särskilja de streckkodade sonderna är också ganska komplex. Vi har funnit att Cy3 och Cy3.5 är att föredra framför Cy5 för fisk experiment. En av begränsningarna i Cy5 färgämnet är dess känslighetatt fotoblekning. Dock har Stellaris nyligen utvecklats Cy5 varianter som marknadsförs som mer motståndskraftiga mot fotoblekning, och kan lindra denna tekniska fråga. Det är också värt att notera att fisk är en dyr metod för att genomföra och att både sångare och Stellaris prober vanligtvis kostar $ 700 - $ 1.000 per probe set, även om priserna för kommersiellt tillgängliga prober bör minska i framtiden. Avvara av reagenser och effektiv märkning ger Singer sonder ner till det lägre intervallet i pris. En av de stora tekniska utmaningarna är separationen av enstaka kontra flera sond fläckar, vilket kräver genomförandet av sofistikerade spot-fastställande algoritmer. Detta kan ta omfattande manuell granskning för att ställa parametrar bildanalys för specifika experimentella uppställningar. En översikt av vårt computational pipeline med relevanta MATLAB-funktioner finns i avsnitt 7 i protokollet. Denna fråga är något lindras genom Stellaris sonder som endast har<html> en etikett per sond. Det kräver därför colocalization av flera sonder för att se en signal. Eftersom FISH kräver fastställande celler, inte underlätta det inte spåra enskilda celler över tiden. Tidigare använde vi uppgifter FISK snapshot att rekonstruera dynamiken i genuttryck i enskilda metaboliskt populationer cykling jäst 6. Metabola cykling observeras i pre-svalt, kontinuerliga odlingar, och kännetecknas av befolkningen hela kollektiva svängningar i syreförbrukning. Dessa svängningar är förknippade med genomet hela svängningar av transkript som uppstår för hälften av alla jästgener vid olika faser av syreförbrukning. Vi försökte att avgöra om metabola cykling var närvarande i osynkroniserade kontinuerliga jästkulturer. Om närvarande bör transkript som är anti-korrelerade i synkrona populationer också anti-korrelerade i osynkroniserade enskilda celler, och vice versa för korrelerade transkript. ENT &quot;&gt; Att rekonstruera dynamiken i mRNA-produktion i tid, måste de observerade snapshot data jämföras med vad som förväntas av en modell av det underliggande beteendet. Det finns teoretiska begränsningar när sådana&quot; ögonblicksbilder &quot;av genuttrycksdata kan användas för att bestämma de underliggande genuttryck dynamik och vilka typer av modeller kan urskiljas 21. För de metaboliska cykeldata, snarare än direkt visar närvaron av tidsmässiga svängningar, har statistiska mätningar genomförs för att styrka att det faktiskt finns en cell autonom oscillerande program överensstämmer med bulk microarray mätningar.

Använda bulk mättekniker, är det inte möjligt att analysera antalet transkript eller transkriptionell aktivitet inom enskilda celler 1. Använda fluorescerande proteiner som drivs av initiativtagarna intresse av uppgiftslämnare i genuttryck kan ta upp denna fråga i viss mån, men den tid som krävs för fluorescerande proteiner att vika döljer tidiga dynamik. Långlivade fluorescerande proteiner kan inte heller rapportera mRNA livslängd. FISH metoden kan användas för att analysera mRNA under dess livscykel, från transkriptionsinitiering i kärnan för efterföljande mognad och förfall i enstaka celler, med enda molekyl upplösning. Originalet in situ experiment för att visualisera nukleinsyror används radiomärkta RNA-prober för att sondera DNA-element. Dessa inkluderade visualisera ribosomal DNA i äggstockarna hos grodan Xenopus laevis 2 och satellit-DNA i musvävnad 3. Den första fluorescent in situ experiment använde en RNA-molekyl märkt med en fluorofor att sondera särskilda DNA-sekvenser 4. Den första tillämpningen av fluorescerande prober för visualisering av RNA in situ var visualisering av aktin genuttryck i kycklingmuskel vävnadskultur 5. På senare tid, i knoppande jäst har FISH använts för att undersöka oscillationer i transkription under jästen metabolisk cykel 6, sönderfallet av mRNA under cellcykelns framskridande 7, och spatial lokalisering av mRNA-transkript under mitos 8. FISH har använts i jäst för att visa att okorrelerade fluktuationer i konstitutivt transkriberade gener, som utgör mer än hälften av alla jästgener, uppstår okorrelerade transkriptionsinitiering 9. I icke-jäst arter, har FISH använts för att identifiera stamceller markörer i musen tarmen 10 och att fastställa att ofullständig penetrans av cell öden kan resultera från stokastiska fluktuationer genuttryck i C.elegans embryon 11. FISH här beskrivna metoden fungerar genom hybridisering färgämnesmärkta, enkelsträngade DNA-prober till mRNA meddelanden. Celler avbildas och mRNA räknas med hjälp av en fläck-detektering algoritm. Enkelsträngade prober kan genereras med en DNA-syntetisator och därefter märkta (här kallad Singer prober) eller beställas kommersiellt som pre-märkta prober (Stellaris prober) 12,13. En stor skillnad mellan sångaren och Stellaris sonder är att sångaren sonderna är längre (~ 50 bp) och är multi-märkta medan Stellaris sonder är korta (~ 20 bp) med endast en etikett per sond, som beskrivs av Raj et al 14. Dessutom använder Stellaris tillvägagångssätt många fler sonder per gen än det av Singer (~ 30 kontra 5 sonder per gen, respektive). Nedan ger vi ett protokoll som beskriver användningen av endera typen av prob. I avsnitt 2, tillhandahåller vi ett protokoll för märkning amino-allyl tymidin-innehållande prober wed en vald Cy färgämne. En översikt över de beräkningssteg som krävs för att identifiera enskilda mRNA fläckar finns i avsnitt 7.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadyl Ribonucleoside Complex</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyticase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5263</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1010954001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03446l</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI, dilactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9564</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Shelton Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6001</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline-sodium citrate (SSC) 20X</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82021-484</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (deionized)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3155</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>150710</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysine (0.01%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Cs-18R15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probes</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Custom order for your desired mRNA sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 96-well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>265300</td>
			<td>Alternative to coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>monofunctional NHS-ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen I Cleaner</td>
			<td>Terra Universal</td>
			<td>9505-00</td>
			<td>Controller (Cat #9505-17 optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td>205SDMLAM</td>
			<td>For operating Plasma-Preen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-UB617R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>X-Cite</td>
			<td>XCT 10-A</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Sets</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD or EMCCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C4742-98-24ER</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of mrna molecules using fluorescence in situ hybridization in saccharomyces cerevisiae

Den Fluorescens in situ hybridisering (FISH)-metoden gör att man kan detektera nukleinsyror i den nativa cellulära miljön. Här ger vi ett protokoll för att använda FISH att kvantifiera antalet mRNA i enskilda jästceller. Celler kan odlas i alla förhållanden av intresse och därefter fixeras och göras genomsläppliga. Därefter sänds flera enkelsträngade deoxioligonukleotider konjugerade till fluorescerande färgämnen används för att märka och visualisera mRNA. Diffraktionsbegränsad fluorescens från enstaka mRNA-molekyler kvantifieras med användning av en fläck-upptäckt algoritm för att identifiera och räkna antalet mRNA per cell. Medan mer standard kvantifiering metoder för Northern-blottar, RT-PCR-och gen microarrays uttryck ger information om genomsnittliga mRNA i bulkpopulation, underlättar FISH både räkningen och lokalisering av dessa mRNA i enstaka celler vid enda molekyl upplösning.

Figur 3 visar typiska histogram beräknade från FISH bilder och används för att bestämma antalet mRNA närvarande i enskilda celler. En viktig fördel med mikroskopi-baserade RNA kvantifiering är att man kan få information om lokalisering av transkript. Till exempel använde vi FISH att identifiera mRNA i enskilda celler med en inducerbar CBF1 allel (Figur 4). Eftersom många mRNA-molekyler är närvarande vid stället för transkription, kan vi identifiera förekomst och lokalisering av transkription platser inuti kärnan. Genom att använda olika färger för att märka mRNA av olika gener, kan man kvantifiera flera mRNA i samma celler. För att demonstrera detta har jästceller inkuberades i närvaro av α-faktor och sorbitol. FUS1 transkription (Quasar670 färgämne, röd) induceras av α-faktor. STL1 transkription (Quasar 570 färgämne, grön) induceras av ökningar i extracellulära osmolaritet ( <strong&gt; Figur 5). Figur 4 är ett exempel på fisk med sångaren sonder. Figur 5 är ett exempel på fisk med Stellaris sonder. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> Figur 1. Schematisk av FISH experimentell procedur. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> Figur 2. Schematisk av bildanalys rörledning. De slutliga fläckarna bestäms i den längst till höger figuren. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> Figur 3. Histogram för slumpvis intensiteter för en viss gen med användning av Singer prober </strong&gt;. Probe intensitet beräknas både inuti (röd) och utanför (blå) celler. Lågintensiva fläckar är antingen brus eller enstaka sönder. Verkliga mRNA meddelanden är märkta med multipla sönder. När du använder Stellaris sonder, ensamstående sönder är mindre detekterbar och därmed tröskelvärdena och filtrering måste anpassas därefter. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> Figur 4. Representativa resultat av Singer FISH förfarande. I detta experiment är CBF1 transkription aktiveras med en inducerbar promotor 18. Kärnorna färgas blå med DAPI. CBF1 mRNA är märkta med Cy3-märkta prober. Vita pilar markerar förekomsten av CBF1 transkription platser i kärnan. Single mRNA-transkript är synliga i cytoplasman. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> Figur 5. Representativa resultat av Stellaris FISH förfarande. MATA jästceller sattes samtidigt exponerades för 30 ng / ml α-faktor och 0,75 M sorbitol under 10 min och tillsattes samtidigt sonderades för FUS1 (Quasar 670, röd) och STL1 (Quasar 570, grön) transkript. I den markerade rutan, kan vi se en cell bara svarar på feromon (FUS1 startwebbplats, röd) och en annan övervägande svara på sorbitol (STL1 start plats, grön).

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Detta protokoll beskriver en experimentell metod för genomförande Fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH) för att räkna mRNA i enskilda celler vid enda molekyl upplösning.

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissekering av Saccharomyces cerevisiae ASCI

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Fluorescens På plats Hybridisering (FISH) Protokoll i mänskliga spermier

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analys för Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

En fluorescensmikroskopi-analys för övervakning Mitophagy i jästen Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Detektering av viralt RNA genom Fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Kopplade Analyser för övervakning Proteinåterveckningssteg i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Mätning av mRNA dämpfaktorer i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Använda<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Stammar

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Enkel metod för fluorescens-DNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering till kläm Kromosomer

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Snabb Identifiering av kemiska genetiska interaktioner i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Cykloheximid Chase Analys av proteinnedbrytning i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...