Name: quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions
Uploaded: 2013-09-22T20:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions at JoVE.com

نحن ممتنون للمناقشات والتوجيه والدعم من الدكاترة. مايكل Andreeff دكتوراه في الطب، دكتوراه، وجاريد بوركس الدكتوراه. من MD اندرسون التدفق الخلوي والخلوية التصوير مرفق الأساسية. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعهد الوطني للسرطان (RC1-CA146381، CA-083639، R01NS06994، وCA116199 CA109451 لFCM. معتمد ELS أيضا من قبل وزارة الدفاع الجيش (BC083397).

مسانج الفئران زرع النخاع (BMT) كما أقرتها المؤسسية بروتوكولات IACUC (ملاحظة: النجاح من هذا البروتوكول يتطلب استخدام أي نوع من الخلايا المسمى (ق) كهدف للتحليل المتعدد الأطياف، وتسهيل تحليل المصب، يمكن للمرء أن يستغل أي الوراثية أو وضع العلامات الخلوية مستقرة. ونق...

<ol>
	<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+the+tumor+microenvironment:+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma.">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563 (2012).</li><li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+(MSCs)+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects.">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li><li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type.">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li><li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992 (2009).</li><li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neighbors+and+distant+invaders:+Tumor-associated+niche+cells.">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+molecular+pathways+and+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li><li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections.">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li><li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections.">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13 (2008).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse.">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li></ol>

هنا وصفنا تطبيق التصوير متعدد الأطياف وصفنا كما الاستجواب MIMicc-متعددة الأطياف من التراكيب الخلوية تعدد، لتحليل نخاع العظام المستمدة من مكونات انسجة المكروية الورم، ولكن هذه المنهجية ومفهوم يمكن تطبيقها على فك رموز العناصر الخلوية الأخرى التي يتكون مجمع الأنسجة مثل...

فهم التنمية الأنسجة وإصلاح مهم لتوضيح المكونات الخلوية المشاركة في التئام الجروح، 2،3 الطب التجديدي، والبيولوجيا التطورية والبيولوجيا الورم. في ظل ظروف من إصلاح، والعديد من أنواع الخلايا التسلل المكروية المحيطة للمساعدة في الأوعية الدموية، ترسب ECM، وانتشار وإعادة هيكلة الأنسجة. ويمكن تحديد العوامل الخلوية والظواهر على أساس multiparameter، علامات المضاعفة التي يمكن أن تحدد توطين، وحالة التمايز والتفاعل بين المكونات الخلوية داخل المكروية التحقيق. هنا، نحن تصف تطور الورم كمثال تنميط لهذا النموذج زرع متعدد الألوان المتعددة الخلايا تليها التصوير متعدد الأطياف ومنهجية unmixing الطيفية. ورم تطور هو عملية متعددة الخطوات التي تم وضع علامة من قبل العديد من القدرات المكتسبة التي تشمل تعزيز الانتشار، وntiapoptotic، الغازية وعائية الخصائص. مما يسهل 4 التنمية الورم عن طريق الخلايا غير الورمية التي يتم تجنيدهم في بيئة المحيطة بها لتوفير عوامل النمو، المصفوفات الهيكلية، وشبكات الأوعية الدموية والتعديل المناعي. يتكون 1،5،6 هذا موئل دقيق من الخلايا المشتقة من والأنسجة المحلية المجاورة مثل الدهنية، والأوعية الدموية ومصادر بعيدة مثل نخاع العظم الخلايا المشتقة 1. مدى دمج الخلايا غير الورمية يعتمد على الطلب من الورم، والتي تتطابق في كثير من الأحيان مع المرحلة / الصف من الورم. لفهم دور الورم المكروية داعمة، لا بد من فهم منشأ وإمكانية التفريق بين السكان الخلية غير الورمية. وقد تم تصميم هذا البروتوكول للمساعدة في تفسير تطور الورم من خلال التصور كل من نخاع العظام المكونات الخلوية المشتقة، والاوعية الأنسجة المحليةإد الخلايا. استخدام الفلورسنت، معربا عن الجين مراسل الفئران المعدلة وراثيا، ونحن زرع نخاع GFP (الخضراء بروتين فلوري) العظام في طلب تقديم العروض المشع القاتلة (بروتين أحمر فلوري) الماوس. بعد نجاح نخاع العظم engraftment، يتم حقن الورم خط الخلية مسانج orthotopically وسمح لتدبر لمدة 4-8 أسابيع. يتم رفعه الورم الناتج عن الماوس ومعالجتها لمناعي (IF) تلطيخ لتصور مكونات اللحمية. مضاعفة IF علامات هي تقنية شائعة الاستخدام التي ينطوي كبيرة الأمثل 7-9، ومع ذلك باستخدام منصة التصوير / unmixing متعددة الأطياف يحسن القدرة على تركيبات علامة فلوري التي تمتلك التداخل الطيفي. هنا نقدم تقنية نسميه الاستجواب MIMicc-متعددة الأطياف من التراكيب الخلوية تعدد في وصمة عار وتحليل ما يصل إلى ثمانية علامات داخل قسم الورم على شريحة واحدة من أجل تحليل أصول الخلوية، وتمايز الخلايا الحادي وآتوس والتفاعلات خلية خلية من المكونات داخل المكروية الورم. هذا مثال مبسط لديه القدرة على أن توسع عليها في أجل تحليل خمسة، ستة، أو أكثر علامات استخدام الأجسام المضادة أو الخلايا يحركها المروج التعبير الفلورسنت. الجدول 1 قوائم الفلورسنت تركيبات تلوين الأجسام المضادة المحتملة مع الأنواع المناسبة تؤخذ بعين الاعتبار.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

مع الرغبة في فهم إسهامات العناصر الخلوية متعددة لتطوير الأنسجة المعقدة؛ مثل العديد من أنواع الخلايا التي تشارك في تجديد الأنسجة، وتشكيل الورم، أو تكون الأوعية، ونحن وضعت نموذجا زرع الخلوية متعددة الألوان التنمية الورم في والتي تنشأ من السكان الخلية المختلفة الملونة مراسل الفئران الجينات fluorescently ويتم زرع، أو حقن المغروسة في وحول وجود ورم النامية. ثم يتم تجنيد هذه الخلايا الملونة ودمجها في سدى الورم. من أجل إجراء تقييم كمي لنخاع العظام المستمدة خلايا انسجة الورم، ونحن زرع GFP معربا المعدلة وراثيا نخاع العظم كله في طلب تقديم العروض المشع قاتل معربا عن الفئران التي وافقت عليها IACUC. تم رفعه الأورام 0ovarian التي تم حقنها في الفئران orthotopically زرعها آخر 6-8 أسابيع engraftment وتحليلها لنخاع العظم علامة من أصل (GFP)، وكذلك الأجسام المضادة للكشف عن علامات الورم المرتبطةسدى باستخدام تقنيات التصوير متعدد الأطياف. نحن بعد ذلك تكييفها منهجية نسميه MIMicc-المتعددة الأطياف الاستجواب من تعدد التراكيب الخلوية، وذلك باستخدام unmixing متعددة الأطياف من fluoroprobes إجراء تقييم كمي والتي وصفت جاء خلية من السكان والتي تبدأ (على أساس تسميات الجين مراسل الأصلي)، وكما قدرتنا على unmix 4، 5 ، 6 أو أكثر لكل أطياف زيادات الشرائح، واضاف لدينا المناعية الإضافية المرتبطة الأنساب الخلية أو التمايز لزيادة الدقة. استخدام برامج للكشف عن إشارات المضاعفة الفلورسنت المترجمة المشترك، ويمكن إرجاع السكان انسجة الورم، وتتميز المذكورة على أساس علامة تلطيخ. 1

باستخدام تقنية التصوير متعدد الأطياف لتحليل الأورام المغروسة في نموذج الفأر وراثيا لدينا BMT، ونحن قادرون على تمييز مكونات الورم اللحمية التي هي من نخاع العظام المنشأ. تم تأكيد BMT الأولية ثلاثة أسابيع بعد الزرع بواسطة التدفق الخلوي (الشكل 1). حقن Orthotopically أورا?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions at JoVE.com

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

الجماهير الأنسجة المعقدة، من الأجهزة للأورام، وتتكون من العناصر الخلوية المختلفة. نحن توضيح مساهمة الظواهر الخلوية داخل الأنسجة باستخدام المسمى متعدد الفئران المعدلة وراثيا الفلورسنت في تركيبة مع multiparameter تلوين مناعي تليها unmixing الطيفية فك الأصل المحمولة، فضلا عن خصائص الخلايا استنادا البروتين التعبير.

تحليل الكمي متعددة الأطياف وبعد زرع الأنسجة نيون لتصور أصول الخليوي، وأنواع، والتفاعلات

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

الكمية التصور والكشف عن سرطان الجلد باستخدام التصوير الحراري الديناميكي

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

تحسين التصور الانبثاث الرئة في قرار خلية واحدة في الفئران عن طريق الجمع بين<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; الإرواء من أنسجة الرئة وX-غال تلوين لل<em&gt; lacZ</em&gt; الكلمات الدلالية الخلايا السرطانية،

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

العزلة نوى Cardiomyocyte من الأنسجة بعد الوفاة

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

التحليل الكمي من Proteomes الكروماتين في الأمراض

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

الفئران غيري مكاني القلب زرع تقنية

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

متعدد القطب تسجيلات صفيف من داء الصرع بعد الجراحة القشرية الأنسجة البشرية

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Murine Kidney Transplant Technique

الكلى الفئران زرع تقنية

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

الوريد الإعتراض نموذج: نموذج مناسب لدراسة الالتفافية الكسب غير المشروع الإنفتاح

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

التصور الكمي من التسلل الكريات البيض في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب مداهم من قبل ورقة ضوء المجهري

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

إصابة القائم على البالون لحمل ميوينتيمال تضخم في الشريان الاورطي البطني الماوس

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...