Name: quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions
Uploaded: 2013-09-22T20:30:00
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Nous sommes reconnaissants à la discussion, l&#39;orientation et le soutien de MM. Michael Andreeff MD, PhD., Et Jared Burks doctorat. du MD Anderson cytométrie en flux et cellulaire Imaging Core Facility. Ce travail a été financé en partie par des subventions de l&#39;Institut national du cancer (RC1-CA146381, CA-083 639, R01NS06994, CA116199 et CA109451 pour FCM. ELS est également soutenu par le Département de l&#39;Armée de Défense (de BC083397).

Syngénique murin de moelle osseuse (GMO), tel qu&#39;approuvé par les protocoles institutionnels IACUC (Note: Le succès de ce protocole nécessite l&#39;utilisation de n&#39;importe quel type de cellule marquée (s) comme cible pour l&#39;analyse multispectrale, et de faciliter l&#39;analyse en aval, on peut exploiter tout génétique ou l&#39;étiquetage cellulaire stable. Nous suggérons que n&#39;importe quelle cellule, tissu ou organe à-être-peut être appliquée à un modèle de transplantatio...

<ol>
	<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+the+tumor+microenvironment:+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma.">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563 (2012).</li><li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+(MSCs)+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects.">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li><li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type.">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li><li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992 (2009).</li><li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neighbors+and+distant+invaders:+Tumor-associated+niche+cells.">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+molecular+pathways+and+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li><li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections.">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li><li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections.">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13 (2008).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse.">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li></ol>

Nous décrivons ici l&#39;application de l&#39;imagerie multispectrale, nous décrivons comme interrogation MIMicc-multispectrale de compositions cellulaires multiplexés, pour analyser la moelle osseuse provenant composantes stromales du microenvironnement de la tumeur, mais cette méthodologie et le concept peut être appliqué à déchiffrer d&#39;autres éléments cellulaires qui composent un complexe tissus tels que ceux observés lors des réactions de cicatrisation des plaies ou lors d&#39;un tissu régénératri...

Comprendre le développement et la réparation tissulaire est important d&#39;élucider les composants cellulaires qui participent à la cicatrisation des plaies, 2,3 médecine régénérative, la biologie du développement et de la biologie de la tumeur. Dans des circonstances de la réparation, de nombreux types de cellules infiltrent le microenvironnement entourant à l&#39;aide de la vascularisation, le dépôt de l&#39;ECM, la prolifération et la restructuration des tissus. Facteurs cellulaires et les phénotypes peuvent être identifiés sur la base de plusieurs paramètres, marqueurs multiplexés qui peuvent identifier la localisation, l&#39;état de la différenciation et de l&#39;interaction entre les composants cellulaires dans le microenvironnement enquête. Ici, nous décrivons le développement de la tumeur comme un exemple typique de ce modèle de greffe multicolore-multicellulaire suivi par imagerie multispectrale et la méthodologie de déconvolution spectrale. La progression tumorale est un processus en plusieurs étapes qui est marquée par plusieurs capacités acquises qui incluent augmentation de la prolifération, unpropriétés ntiapoptotic, invasives et angiogéniques. 4 développement de la tumeur est facilitée par des cellules non néoplasiques qui sont recrutés dans l&#39;environnement à fournir des facteurs de croissance, des matrices structurelles, les réseaux vasculaires et la modulation immunitaire. 1,5,6 Ce micro-habitat est constitué de cellules dérivées de , les tissus locaux voisins tels que le tissu adipeux, et les vaisseaux sanguins et les sources lointaines comme la moelle osseuse des cellules dérivées 1. L&#39;étendue de l&#39;incorporation des cellules non-néoplasiques dépend de la demande à partir de la tumeur, ce qui correspond souvent à l&#39;étape / grade de la tumeur. Pour comprendre le rôle du micro-environnement de la tumeur de support, il faut comprendre l&#39;origine et le potentiel de différenciation des populations de cellules non néoplasiques. Ce protocole a été conçu pour aider à l&#39;interprétation de la progression de la tumeur par le biais de la visualisation à la fois des composants cellulaires dérivées de la moelle osseuse, et la deriv tissulaire localecellules ed. Utilisant des souris fluorescentes de gènes exprimant journaliste transgéniques, nous avons transplanté GFP (protéine fluorescente verte) de la moelle osseuse dans un DP mortellement irradié (protéine rouge fluorescente) de la souris. Suite au succès la prise de greffe de moelle osseuse, une lignée cellulaire de tumeur syngénique est injecté orthotopique et on le laisse se greffer à 4-8 semaines. La tumeur résultant est excisé de la souris et traitées pour immunofluorescence (IF) pour visualiser la coloration des composants du stroma. Multiplexage SI marqueurs est une technique couramment utilisée qui implique une optimisation considérable 9.7, mais en utilisant une plate-forme d&#39;imagerie / de démixage multispectral améliore le potentiel de combinaisons de marqueurs fluorescents qui possèdent un recouvrement spectral. Nous présentons ici une technique que nous appelons interrogation MIMicc-multispectrale de compositions cellulaires multiplexés pour colorer et analyser jusqu&#39;à huit marqueurs d&#39;une section de la tumeur sur une seule lame afin d&#39;analyser les origines cellulaires, la différenciation cellulaire stATU et les interactions cellule-cellule des composants dans le microenvironnement tumoral. Cet exemple simplifié a le potentiel d&#39;être développée afin d&#39;analyser cinq, six, ou plusieurs marqueurs utilisant des anticorps ou intracellulaire expression fluorescent promoteur-entraînée. Tableau 1 énumère potentiels fluorescentes combinaisons anticorps de coloration avec des espèces appropriées prises en compte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

Avec la volonté de comprendre les contributions des éléments cellulaires multiples à l&#39;élaboration d&#39;un tissu complexe, tels que les nombreux types cellulaires qui participent à la régénération du tissu, formation d&#39;une tumeur, ou la vasculogenèse, nous avons conçu un modèle de transplantation cellulaire multicolore de développement de tumeurs chez populations de cellules qui proviennent de différentes souris à gène rapporteur colorées par fluorescence et sont transplantés, greffés ou injectés dans et autour d&#39;une tumeur en développement. Ces cellules colorées sont ensuite recrutés et incorporés dans le stroma tumoral. Afin d&#39;évaluer quantitativement les cellules stromales de tumeurs dérivées de la moelle osseuse, nous avons transplanté exprimant la GFP ensemble transgénique moelle osseuse en DP mortellement irradié exprimer souris approuvé par IACUC. 0ovarian tumeurs qui ont été injectés de manière orthotopique dans les souris greffées ont été excisés 6-8 semaines après la prise de greffe et analysés pour le marqueur de la moelle osseuse d&#39;origine (GFP) ainsi que des marqueurs d&#39;anticorps pour détecter associé à une tumeurstroma en utilisant des techniques d&#39;imagerie multispectrale. Nous avons ensuite adapté une méthode que nous appelons MIMicc-multispectrale Interrogation de compositions cellulaires multiplexés, en utilisant unmixing multispectrale de fluoroprobes d&#39;évaluer quantitativement qui marqué cellule est venu à partir de laquelle les populations de départ (basé sur les étiquettes d&#39;origine de gènes rapporteurs), et que notre capacité à unmix 4, 5 , 6 ou plusieurs spectres par glissement augmente, nous avons ajouté immunohistochimie supplémentaire associée à des lignées cellulaires ou la différenciation pour augmenter la précision. Utilisant le logiciel pour détecter les signaux multiplexés fluorescent co-localisées, les populations du stroma de la tumeur peuvent être tracées, énumérés et caractérisés en fonction de marqueur coloration. 1

En utilisant une technique d&#39;imagerie multispectrale pour analyser les tumeurs greffées dans notre modèle de souris transgénique BMT, nous sommes en mesure de discerner les composants de tumeurs stromales qui sont d&#39;origine de la moelle osseuse. La première greffe de moelle osseuse a été confirmé trois semaines après la transplantation par cytométrie de flux (Figure 1). Orthotopiquement injecté tumeurs ovariennes non étiquetés suivant BMT confirmations de prise de greffe ont été ex...

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Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Masses tissulaires complexes, à partir d&#39;organes à des tumeurs, sont composées de différents éléments cellulaires. Nous avons élucidé la contribution des phénotypes cellulaires dans un tissu en utilisant des souris transgéniques fluorescentes marquées multi-paramètres multiples en combinaison avec la coloration par immunofluorescence suivie par déconvolution spectrale de déchiffrer l&#39;origine de la cellule ainsi que les caractéristiques des cellules sur la base de l&#39;expression de protéine.

Analyse quantitative multispectrale Après transplantation de tissu fluorescent pour la visualisation des origines cellulaires, types et Interactions

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

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