Name: quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions
Uploaded: 2013-09-22T20:30:00
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Wir sind dankbar, dass die Gespräche, Beratung und Unterstützung von Drs. Michael Andreeff MD, PhD., Und Jared Burks PhD. aus dem MD Anderson Durchflusszytometrie und Cellular Imaging Core Facility. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem National Cancer Institute (RC1-CA146381, CA-083639, R01NS06994, CA116199 CA109451 und für FCM unterstützt. ELS wird auch von der Armee Department of Defense (BC083397) unterstützt.

Syngene Murine Knochenmarktransplantation (KMT), wie von institutionellen IACUC Protokolle zugelassen (Hinweis: Der Erfolg dieses Protokoll erfordert den Einsatz aller markierten Zelltyp (en) als Ziel für die multispektrale Analyse und die nachgelagerten Analyse zu erleichtern, kann man die genetische nutzen oder stabilen Zellmarkierung. Wir schlagen vor, dass jede Zelle, Gewebe, Organ-oder-zu-sein kann zu einem Transplantationsmodell und die Transplantation kann so viele einzigartige markierten Popula...

<ol>
	<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+the+tumor+microenvironment:+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma.">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563 (2012).</li><li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+(MSCs)+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects.">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li><li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type.">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li><li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992 (2009).</li><li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neighbors+and+distant+invaders:+Tumor-associated+niche+cells.">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+molecular+pathways+and+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li><li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections.">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li><li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections.">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13 (2008).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse.">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li></ol>

Hier beschreiben wir die Anwendung der multispektralen Bildgebung beschreiben wir, wie multispektrale MIMicc-Abfrage der Multiplex-Zellmassen, die Knochenmark Stromazellen Komponenten der Tumor-Mikroumgebung zu analysieren, aber diese Methode und Konzept kann auf die Entschlüsselung anderen zellulären Elemente, die eine komplexe Komposition angewendet werden Gewebe, wie sie bei Wundheilungsreaktionen oder während eines regenerierbaren Gewebes gesehen. In diesen Experimenten verwenden wir transgene Mäuse fluoreszenz ...

Das Verständnis der Gewebeentwicklung und Reparatur ist wichtig, um die Aufklärung beteiligten zellulären Komponenten in der Wundheilung, 2,3 regenerativen Medizin, Entwicklungsbiologie und Tumorbiologie. Unter Umständen, der Reparatur, zahlreiche Zelltypen zu infiltrieren das umgebende Mikromilieu in Vaskularisation, ECM-Ablagerung, Proliferation und Umstrukturierung des Gewebes zu unterstützen. Zellulären Faktoren und Phänotypen kann basierend auf Multi Multiplex-Marker, die die Lokalisierung identifizieren, Differenzierungsstatus und die Interaktion zwischen Zellkomponenten innerhalb des untersuchten Mikro identifiziert werden. Hier beschreiben wir die Tumorentwicklung als prototypisches Beispiel für diese multicolor-vielzelligen Transplantationsmodell gefolgt von multispektrale Bildgebung und Entmischung Methodik. Tumorprogression ist ein mehrstufiger Prozess, der von mehreren erworbenen Fähigkeiten, die verbesserte Proliferation, eine umfassen markiertntiapoptotic, invasive und angiogenen Eigenschaften. 4 Tumorentwicklung wird durch nicht-neoplastischen Zellen, die in der Umgebung eingestellt werden, um Wachstumsfaktoren, strukturellen Matrix, Gefäßnetze und Immunmodulation bereitzustellen erleichtert. 1,5,6 Diese Mikrohabitat besteht aus Zellen, abgeleitet von lokalen, benachbarten Geweben wie Fettgewebe und Blutgefäße und entfernten Quellen wie Knochenmark gewonnenen Zellen ein. Das Ausmaß der nicht-neoplastischen Zelle Aufnahme hängt von der Nachfrage aus dem Tumor, die oft mit der Bühne / Grad des Tumors entspricht. Um die Rolle der Tumormikroumgebung zu verstehen, muß man den Ursprung und das Differenzierungspotential der nicht-neoplastischen Zellpopulationen verstanden. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um bei der Interpretation der Tumorprogression durch die Visualisierung der beiden Knochenmark abgeleiteten Zellkomponenten zu unterstützen und die lokale Gewebe derivED-Zellen. Mit Hilfe fluoreszierenden Reporter-Gen-exprimierenden transgenen Mäusen transplantiert wir GFP (grün-fluoreszierenden Proteins) Knochenmark in einem letal bestrahlten RFP (rot-fluoreszierende Protein) Maus. Nach der erfolgreichen Knochenmark Transplantation wird eine syngene Tumorzelllinie orthotop injiziert und für 4-8 Wochen einprägen. Die daraus resultierende Tumor aus der Maus herausgeschnitten und für Immunfluoreszenz-(IF)-Färbung, die Stroma-Komponenten visualisieren verarbeitet. Multiplex-IF-Marker ist eine häufig verwendete Technik, die signifikante Optimierung 7-9 beinhaltet, jedoch unter Verwendung eines multispektrale Bild / Entmischung Plattform verbessert das Potential für fluoreszierende Markerkombinationen, die spektrale Überlappung aufweisen. Hier stellen wir eine Technik, die wir nennen MIMicc-Abfrage von multispek Multiplexed Zellzusammensetzungen zu färben und zu analysieren, bis zu acht Marker innerhalb eines Tumors Abschnitt auf einer einzelnen Folie, um die zelluläre Herkunft, Zelldifferenzierung st analysierenATUS und Zell-Zell-Wechselwirkungen von Komponenten innerhalb der Tumormikroumgebung. Dieses vereinfachte Beispiel hat das Potential auf, um fünf, sechs oder mehr Markern unter Verwendung von Antikörpern oder intrazelluläre Fluoreszenz Promotor getriebene Expression. Tabelle 1 zeigt potentielle Fluoreszenzantikörperfärbung Kombinationen mit geeigneten Arten berücksichtigt analysieren erweitert werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

Mit dem Wunsch, die Beiträge von mehreren Zellelemente auf die Entwicklung eines komplexen Gewebe zu verstehen, wie die zahlreichen Zelltypen, die bei der Regeneration von Gewebe, Tumorbildung oder Vaskulogenese zu beteiligen, entwickelten wir ein mehrfarbiges Zelltransplantationsmodell der Tumorentwicklung in welche Zellpopulationen stammen aus verschiedenen fluoreszierend gefärbten Reportergen-Mäusen transplantiert und, gepfropft oder in und um einen Tumor zu entwickeln injiziert. Diese farbigen Zellen werden dann rekrutiert und in den Tumor Stroma eingearbeitet. Um die quantitative Erfassung Knochenmark Tumor Stroma-Zellen transplantiert wir GFP-exprimierenden transgenen ganze Knochenmark in letal bestrahlten Mäusen RFP exprimieren wie IACUC genehmigt. 0ovarian Tumoren, die orthotop in die transplantierten Mäusen injiziert wurden, wurden 6-8 Wochen nach der Transplantation entnommen und für die Knochenmark-Marker der Herkunft (GFP) sowie Antikörper-Markierungen, um Tumor-assoziierte erkennen analysiertStroma mit multispektrale Imaging-Techniken. Wir haben dann eine Methodik angepasst nennen wir MIMicc-Multispektrale Abfrage der Multiplex-Zellmassen mit multispektralen Entmischung fluoroprobes quantitativ zu beurteilen, welche Zelle kam, von dem ausgehend Populationen (basierend auf Original-Reportergens Etiketten), und unsere Fähigkeit, entmischen 4, 5 beschriftet , 6 oder mehr Spektren pro Folie steigt, haben wir zusätzliche Immunhistochemie mit Zelllinien oder Differenzierung, um eine höhere Präzision assoziiert aufgenommen. Den Einsatz von Software zu co-lokalisiert Multiplex-Fluoreszenzsignale, Tumor-Stroma-Bevölkerung verfolgt, aufgezählt und auf der Grundlage Marker Färbung charakterisiert werden zu erkennen. 1

Mit einem multispektrale Imaging-Technik, um Tumore in unserem BMT transgenen Mausmodell eingepflanzt zu analysieren, können wir Stromatumoren Komponenten, die von Knochenmark Herkunft zu erkennen. Die Anfangs BMT wurde 3 Wochen nach der Transplantation mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 1) bestätigt. Orthotop injiziert unmarkierten Eierstock-Tumoren nach Transplantation BMT Bestätigungen wurden herausgeschnitten und Formalin fixiert 6 Wochen nach der ersten Tumorinjektion. Paraffin eingebettete...

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Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Komplexe Gewebemassen, von Organen, Tumoren, werden von verschiedenen zellulären Elementen. Wir erläutert den Beitrag von zellulären Phänotypen innerhalb eines Gewebes unter Verwendung von Multi-markierte Fluoreszenz-transgenen Mäusen in Kombination mit Multiimmunfluoreszenzfärbung gefolgt von Entmischung, den Zellursprung sowie Zelleigenschaften auf der Basis der Proteinexpression zu entschlüsseln.

Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

Quantitative Visualisierung und Erkennung von Hautkrebs mit Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Forschung

Medizin

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusion des Lungengewebes und X-Gal Färbung von<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolierung von Kardiomyozyten Kerne von Post-mortem Gewebe

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

Murine Heterotope Heart Transplant-Technik

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Multi-Elektroden-Array Recordings of Human Epileptische Postoperative Rindengewebe

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Murine Kidney Transplant Technique

Murine Nierentransplantations Technik

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Vein Interposition Modell: ein geeignetes Modell zur Untersuchung Bypass Graft Durchgängigkeit

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

Ballon-basierte Verletzungen induzieren Myointimal Hyperplasie in der Bauchschlagader Maus

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...