Name: quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions
Uploaded: 2013-09-22T20:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions at JoVE.com

אנו אסירי תודה לדיונים, ההדרכה ותמיכה מבני הזוג. מיכאל Andreeff MD, PhD., וג&#39;ארד Burks דוקטורט. מMD Anderson cytometry הזרימה והמתקן נייד Core הדמיה. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקים מהמכון הלאומי לסרטן (RC1-CA146381, CA-083,639, R01NS06994, CA116199 וCA109451 לFCM. ELS נתמך גם על ידי מחלקת צבא הגנה (BC083397).

Syngeneic Murine להשתלת מח עצם (BMT) כפי שאושרה על ידי פרוטוקולי IACUC מוסדיים (הערה: הצלחה של פרוטוקול זה דורשת ניצול מכל סוג שכותרתו תא (ים) כיעד לניתוח multispectral, וכדי להקל על הניתוח במורד הזרם, אפשר לנצל כל גנטית או תיוג סלולארי יציב. אנו מציעים כי כל תא, רקמה, או יכול להיו?...

<ol>
	<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+the+tumor+microenvironment:+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma.">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563 (2012).</li><li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+(MSCs)+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects.">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li><li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type.">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li><li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992 (2009).</li><li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neighbors+and+distant+invaders:+Tumor-associated+niche+cells.">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+molecular+pathways+and+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li><li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections.">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li><li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections.">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13 (2008).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse.">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li></ol>

במסמך זה אנו מתארים את היישום של ההדמיה multispectral אנו מתארים כחקירת MIMicc-multispectral של יצירות סלולריות Multiplexed, לנתח את רכיבי סטרומה שמקורם במח העצם של microenvironment הגידול, לעומת זאת מתודולוגיה זו ורעיון יכולים להיות מיושמים לפענוח מרכיבים תאיים אחרים המרכיבים את מתחם רקמות כמו...

הבנת התפתחות ותיקון רקמות היא משמעותית להבהרת מרכיבים תאיים משתתפים בריפוי פצעים, 2,3 רפואת רגנרטיבית, ביולוגיה התפתחותית וביולוגיה של גידול. בנסיבות של תיקון, סוגים רבים של תאים לחדור microenvironment שמסביב כדי לסייע בכלי דם, בתצהיר ECM, שגשוג ובנייה מחדש של רקמות. ניתן לזהות גורמים ופנוטיפים סלולריים המבוססים על פרמטרים מרובים, סמנים מרובבים שיכול לזהות את הלוקליזציה, מצב בידול ויחסי גומלין בין מרכיבים תאיים בתוך microenvironment נחקר. במסמך זה, אנו מתארים את התפתחות גידול כדוגמא טיפוסית למודל השתלה זו ססגוניות-תאית ואחרי ההדמיה multispectral ומתודולוגיה unmixing רפאים. התקדמות גידול היא תהליך רב שלבי שהתאפיין במספר יכולות שנרכשו הכוללות משופרת התפשטות,מאפייני ntiapoptotic, פולשנית ואנגיוגנזה. התפתחות גידול 4 הוא הקלה על ידי תאים שאינם neoplastic כי הם גויסו לסביבה כדי לספק גורמי גדילה, מטריצות מבניות, רשתות כלי דם ואפנון חיסוניים. 1,5,6 microhabitat זה מורכב מהתאים שמקורם רקמות מקומיות, שכנות כמו שומן, וכלי דם ומקורות רחוקים, כמו תאים שמקורם במח עצם 1. התאגדות מסוג התאים לא neoplastic מידת ההשפעה תלויה בביקוש מהגידול, אשר לעתים קרובות תואם את השלב / הכיתה של הגידול. כדי להבין את תפקידו של המיקרו תומך הגידול, יש להבין את מקורו ואת פוטנציאל ההתמיינות של אוכלוסיות תאים שאינם neoplastic. פרוטוקול זה תוכנן כדי לסייע בפרשנות של התקדמות גידול באמצעות ההדמיה של שני מרכיבים התאיים שמקורם במח העצם, וderiv הרקמות המקומיתed תאים. ניצול עכברים להביע גן כתב ניאון מהונדסים, אנחנו מושתלים GFP מח עצם (חלבון ירוק ניאון) לRFP קטלני מוקרן עכבר (חלבון אדום ניאון). בעקבות קליטתם מח עצם מוצלחת, שורת תאים הסרטני syngeneic מוזרקת orthotopically ואפשרה לנקלטת ל4-8 שבועות. הגידול וכתוצאה מכך הוא נכרת מהעכבר ומעובד לimmunofluorescent (IF) מכתים לדמיין את רכיבי סטרומה. ריבוב אם סמנים הוא טכניקה הנפוצה שכרוכה באופטימיזציה משמעותית 7-9, זאת תוך שימוש בפלטפורמת ההדמיה / unmixing multispectral משפר את הפוטנציאל לשילובי סמן פלואורסצנטי שיש להם חפיפה ספקטרלית. במסמך זה אנו מציגים טכניקה שאנחנו מכנים חקירת MIMicc-multispectral של יצירות סלולריות Multiplexed להכתים ולנתח עד שמונה סמנים בתוך קטע גידול בשקופית אחת על מנת לנתח את המקורות התאיים, התמיינות תאית status ותאי תאי אינטראקציות של רכיבים בתוך microenvironment הגידול. יש דוגמא פשוטה זו יש הפוטנציאל להיות מורחב על מנת לנתח חמש, שש, או יותר סמני ניצול נוגדנים או ביטוי תאיים מונע אמרגן ניאון. לוח רשימות 1 שילובי מכתים נוגדן ניאון פוטנציאליים עם מינים מתאימים נלקחו בחשבון.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

עם הרצון להבין את תרומתם של מרכיבים תאיים רבים להתפתחות של רקמות מורכבות, כגון סוגי תאים רבים המשתתפים בהתחדשות רקמות, היווצרות גידול, או vasculogenesis, אנחנו המצאתי מודל השתלה סלולרית צבעונית של התפתחות גידול ב שאוכלוסיות תאים שמקורם מעכברים שונים fluorescently צבע כתב גן והם מושתלים, engrafted או מוזרק ובסביבת גידול מתפתחת. לאחר מכן תאים צבעוניים אלה גויסו ושולבו בstroma הגידול. על מנת להעריך כמותית תאי סטרומה מח עצם נגזרים גידול, אנו מושתלים GFP להביע מח עצם כולו מהונדס לתוך RFP קטלני מוקרן להביע עכברים כפי שאושר על ידי IACUC. גידולי 0ovarian שהוזרקו orthotopically לעכברים המושתלים היו נכרת לאחר 6-8 שבועות engraftment וניתחו עבור סמן מח עצם ממקור (GFP), כמו גם סמני נוגדנים לזהות גידול קשורstroma תוך שימוש בטכניקות הדמיה multispectral. לאחר מכן, אנו הותאמו המתודולוגיה שאנו מכנים MIMicc-Multispectral חקירה של יצירות סלולריות Multiplexed, באמצעות unmixing multispectral של fluoroprobes להעריך כמותית שכותרתו התא בא ממנה האוכלוסיות מתחילות (המבוססות על תוויות גן כתב מקוריות), וכמו היכולת שלנו unmix 4, 5 , 6 או יותר ספקטרום לעליות שקופיות, הוספנו אימונוהיסטוכימיה נוספת הקשורות לשושלות תאים או בידול כדי להגדיל את הדיוק. ניצול תוכנה כדי לזהות אותות מרובבים-ניאון מקומי משותף, ניתן לייחס אוכלוסיות סטרומה גידול, מנויות ומאופיינות מבוססות על כתמי סמן. 1

שימוש בטכניקת הדמיה multispectral לנתח גידולי engrafted במודל העכבר המהונדס שלנו BMT, אנו מסוגלים להבחין במרכיבי גידול סטרומה שהם ממוצא מח עצם. BMT הראשוני אושר שלושה שבועות לאחר השתלה על ידי cytometry זרימה (איור 1). Orthotopically הזריק גידולי השחלות ללא תווית הבאה אישורי engraftment BMT ה...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions at JoVE.com

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

המוני רקמות מורכבים, מאיברים לגידולים, מורכבים מאלמנטים הסלולר שונים. אנו הובהר התרומה של פנוטיפים הסלולר בתוך רקמת ניצול עכברים הטרנסגניים ניאון רב שכותרתו בשילוב עם מכתים immunofluorescent multiparameter אחרי unmixing רפאים לפענח מוצא תא, כמו גם מאפייני תא המבוססים על ביטוי חלבון.

כמותיים Multispectral ניתוח בעקבות השתלת רקמות פלורסנט וליזואליזציה של מקורות ניידים, סוגים, ואינטראקציות

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

ויזואליזציה כמותי וזיהוי של סרטן העור באמצעות הדמיה תרמית Dynamic

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב<em&gt; באתרו</em&gt; זלוף של רקמת ריאה וכתמי X-גל של<em&gt; LacZ</emגידול תאים&gt; תייג-

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

ניתוח הכמות של Proteomes הכרומטין במחלות

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

טכניקת השתלות Murine Heterotopic לב

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

הקלטות מערך רב-אלקטרודה של רקמה האנושית אפילפטיים לאחר הניתוח בקליפת המוח

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Murine Kidney Transplant Technique

טכניקת השתלת כליה בעכברים

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

וריד ביון דגם: מודל מתאים ללמוד patency מעקף

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

ויזואליזציה כמותית של ליקוציטים לחדור במודל Murine של שריר הלב הדוקרני על ידי מיקרוסקופית גיליון אור

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

מבוסס על בלון פציעה לזירוז היפרפלזיה Myointimal באבי העורקים בטן העכבר

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...