Name: quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions
Uploaded: 2013-09-22T20:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions at JoVE.com

Siamo grati al dibattito, orientamento e sostegno da Drs. Michael Andreeff MD, PhD., E Jared Burks PhD. dal MD Anderson Citometria a flusso e Cellular Imaging Nucleo strumento. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal National Cancer Institute (RC1-CA146381, CA-083639, R01NS06994, CA116199 e CA109451 per FCM. ELS è sostenuto anche dal Dipartimento dell&#39;Esercito di Difesa (BC083397).

Singenico Murino trapianto di midollo osseo (BMT), come approvato dai protocolli istituzionali IACUC (Nota: Il successo di questo protocollo richiede l&#39;utilizzo di qualsiasi tipo di cellula marcata (s) come destinazione per l&#39;analisi multispettrale, e per facilitare l&#39;analisi a valle, si può sfruttare qualsiasi genetica o etichettatura cellulare stabile. Suggeriamo che ogni cellula, tessuto o organo-a-essere può essere applicato a un modello di trapianto e che il trapianto può contenere m...

<ol>
	<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+the+tumor+microenvironment:+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma.">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563 (2012).</li><li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+(MSCs)+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects.">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li><li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type.">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li><li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992 (2009).</li><li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neighbors+and+distant+invaders:+Tumor-associated+niche+cells.">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+molecular+pathways+and+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li><li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections.">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li><li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections.">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13 (2008).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse.">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li></ol>

Qui si descrive l&#39;applicazione dell&#39;imaging multispettrale descriviamo come interrogazione MIMicc-multispettrale di composizioni cellulari multiplexati, per analizzare le componenti stromali del midollo osseo derivate del microambiente tumorale, tuttavia questa metodologia e concetto può essere applicato per decifrare altri elementi cellulari che compongono un complesso tessuti come quelli osservati durante le reazioni di cicatrizzazione o durante un tessuto rigenerativo. In questi esperimenti utilizziamo topi ...

Comprendere lo sviluppo dei tessuti e la riparazione è significativo per chiarire che partecipano componenti cellulari nella guarigione delle ferite, 2,3 medicina rigenerativa, biologia dello sviluppo e biologia del tumore. In circostanze di riparazione, numerosi tipi di cellule infiltrano il microambiente circostante per aiutare nella vascolarizzazione, ECM deposizione, la proliferazione e la ristrutturazione dei tessuti. Fattori cellulari e fenotipi possono essere identificati sulla base di multiparametrico, marcatori multiplex che possono identificare la localizzazione, stato di differenziazione e l&#39;interazione tra componenti cellulari all&#39;interno del microambiente indagato. Qui, descriviamo lo sviluppo del tumore come un esempio tipico di questo modello di trapianto multicolor-multicellulare seguita da immagini multispettrali e la metodologia unmixing spettrale. Progressione tumorale è un processo a più fasi che è segnata da diverse funzionalità acquisite che includono una maggiore proliferazione, unproprietà ntiapoptotic, invasive e angiogenici. 4, dello sviluppo tumorale è facilitata da cellule non neoplastiche che vengono reclutate nell&#39;ambiente circostante per fornire fattori di crescita, matrici strutturali, reti vascolari e modulazione immunitaria. 1,5,6 Questo microhabitat consiste di cellule derivate da , i tessuti locali vicini come adiposo e vasi sanguigni e fonti lontane come il midollo osseo cellule derivate 1. Il grado di incorporazione di cellule non neoplastiche dipende dalla richiesta dal tumore, che spesso corrisponde con la fase / grado del tumore. Per comprendere il ruolo del microambiente tumorale solidale, si deve capire l&#39;origine e il potenziale di differenziazione delle popolazioni di cellule non neoplastiche. Questo protocollo è stato progettato per favorire l&#39;interpretazione della progressione tumorale attraverso la visualizzazione sia dei componenti cellulari derivate midollo osseo, e la deriv tessuto localecellule ed. Utilizzando fluorescenti giornalista-gene che esprime topi transgenici, abbiamo trapiantato GFP (proteina verde fluorescente) del midollo osseo in una RFP letale irradiato (proteina rosso fluorescente) del mouse. Dopo il successo attecchimento del midollo osseo, una linea di cellule tumorali singenico viene iniettato ortotopicamente e ha permesso di attecchire per 4-8 settimane. Il tumore risultante viene asportato dal mouse e trattati per immunofluorescenza (IF) colorazione di visualizzare i componenti stromali. Multiplexing IF marcatori è una tecnica comunemente usata che prevede una significativa ottimizzazione 7-9, ma utilizzando una piattaforma di imaging / unmixing multispettrale migliora il potenziale di combinazioni di marcatori fluorescenti che possiedono sovrapposizione spettrale. Qui vi presentiamo una tecnica che chiamiamo interrogatorio MIMicc-multispettrale di composizioni cellulari multiplexati a macchiare e analizzare fino a otto marcatori all&#39;interno di una sezione di tumore su una singola diapositiva, al fine di analizzare le origini cellulare, differenziamento cellulare strecchi e le interazioni cellula-cellula delle parti entro il microambiente tumorale. Questo esempio semplificato ha il potenziale per essere ampliato su per analizzare cinque, sei o più marker utilizzando anticorpi o di espressione fluorescente intracellulare promotore-driven. Tabella 1 elenca i potenziali combinazioni di anticorpi fluorescenti colorazione con specie adatte presi in considerazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

Con il desiderio di comprendere contributi di molteplici elementi cellulari allo sviluppo di un tessuto complesso, come i numerosi tipi di cellule che partecipano rigenerazione tissutale, formazione di tumori, o vasculogenesi, abbiamo ideato un multicolore modello trapianto cellulare di sviluppo del tumore in che le popolazioni di cellule provengono da diversi colori giornalista topi del gene modo fluorescente e vengono trapiantate, innestate o iniettati dentro e intorno un tumore in via di sviluppo. Queste cellule colorate vengono poi reclutati e inseriti nel stroma tumorale. Al fine di valutare quantitativamente midollo osseo derivate cellule stromali del tumore, abbiamo trapiantato GFP che esprimono tutta transgenica midollo osseo in RFP letale irraggiato esprimere topi come approvato dalla IACUC. 0ovarian tumori che sono stati ortotopicamente iniettato nei topi trapiantati sono stati asportati 6-8 settimane dopo l&#39;attecchimento e analizzati per marcatore midollo osseo di origine (GFP) e marcatori anticorpali per rilevare tumore associatostroma utilizzando tecniche di imaging multispettrale. Abbiamo poi adattato una metodologia che chiamiamo MIMicc-multispettrale Interrogatorio di composizioni cellulari multiplex, utilizzando unmixing multispettrale di fluoroprobes per valutare quantitativamente cui etichettato cellule venuto da cui le popolazioni a partire (in base giornalista originali etichette geni), e la nostra capacità di unmix 4, 5 , 6 o più spettri per aumenti di diapositive, abbiamo aggiunto immunoistochimica aggiuntivi associati a linee cellulari o differenziazione per aumentare la precisione. Utilizzando il software di rilevare i segnali multiplex fluorescente co-localizzate, le popolazioni stromali tumorali possono essere rintracciati, annotate e caratterizzate sulla base di marcatore colorazione. 1

Usando una tecnica di imaging multispettrale per analizzare i tumori innestati nel nostro modello di topo transgenico BMT, siamo in grado di discernere i componenti tumori stromali che sono di origine midollare. Il primo BMT è stata confermata tre settimane post-trapianto mediante citometria di flusso (Figura 1). Ortotopicamente iniettato tumori ovarici senza etichetta seguente BMT conferme attecchimento sono stati asportati e fissati in formalina 6 settimane dopo l&#39;iniezione iniziale del tumore. P...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions at JoVE.com

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Masse di tessuto complesse, da organi di tumori, sono composti da vari elementi cellulari. Abbiamo chiarito il contributo di fenotipi cellulari all&#39;interno di un tessuto utilizzando multi-etichettati topi transgenici fluorescenti in combinazione con multiparametrica immunofluorescenza seguita da unmixing spettrale di decifrare origine cellulare e caratteristiche cellulari basati su espressione della proteina.

Quantitative Analysis multispettrali Dopo tessuto fluorescente Trapianto per la visualizzazione delle origini cellulari, tipi e interazioni

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

Visualizzazione quantitativa e diagnosi del tumore della pelle utilizzando Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Ricerca

Medicina

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Una migliore visualizzazione delle metastasi polmonari a risoluzione singola cella in Mouse di combinata<em&gt; In-situ</emPerfusione&gt; del tessuto polmonare e X-Gal colorazione del<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged cellule tumorali

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolamento dei Nuclei Cardiomyocyte dal post-mortem del tessuto

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

Analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

Murini eterotopica cuore Tecnica Trapianto

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Multi-elettrodi array registrazioni di umano Epileptic postoperatoria corticale del tessuto

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Murine Kidney Transplant Technique

Rene Murine Tecnica trapianto

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Vena interposizione Modello: un modello adatto per studiare Bypass Graft pervietà

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Visualizzazione quantitativa di leucociti infiltrati in un modello di murina della miocardite fulminante mediante microscopia a foglio chiaro

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

Basato su palloncino ferita per indurre iperplasia Myointimal nell'Aorta addominale di Mouse

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...