Name: quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions
Uploaded: 2013-09-22T20:30:00
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私たちは、博士からのディスカッション、指導·支援に感謝しています。マイケルAndreeff氏医学博士。、そしてジャレッドバークス博士号。 MDアンダーソンフローサイトメトリーおよび細胞イメージング基盤施設から。この作品は、FCMのための国立がん研究所（RC1-CA146381、CA-083639、R01NS06994、CA116199およびCA109451からの助成金によって部分的にサポートされていました。ELSも国防軍学科（BC083397）でサポートされています。

同系マウス骨髄移植（BMT）は、制度的IACUCプロトコルによって承認された（ 注：このプロトコルの成功は、マルチスペクトル解析の対象として任意の標識細胞タイプ（S）の利用を必要とし、下流の分析を容易にするためには、任意の遺伝性を利用することができますまたは安定な細胞性標識我々は任意の細胞、組織、または器官に被移植モデルに適用した研究が有用と認める移?...

<ol>
	<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+the+tumor+microenvironment:+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma.">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563 (2012).</li><li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+(MSCs)+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects.">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li><li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type.">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li><li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992 (2009).</li><li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neighbors+and+distant+invaders:+Tumor-associated+niche+cells.">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+molecular+pathways+and+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li><li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections.">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li><li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections.">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13 (2008).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse.">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li></ol>

ここに、我々は腫瘍微小環境の骨髄由来間質成分を分析するために、多重化された細胞組成物のMIMicc - マルチスペクトル尋問として記述するマルチスペクトルイメージングのアプリケーションを記述し、しかし、この方法論や概念が複雑に構成する他の細胞要素を解読に適用することができこのような創傷治癒反応中または回生組織中に​​見られるような組織。これらの実験において、我...

組織の発生と修復を理解することは、創傷治癒、2,3再生医療、発生生物学および腫瘍生物学に参加して細胞成分の解明にとって重要である。修復の状況下では、多数の細胞型は、血管新生、ECM沈着、増殖および組織再構築を支援するために周囲の微小環境に浸潤する。細胞性因子および表現型マルチパラメータ、局在を同定することができる多重化マーカー、分化状態、調査微小環境内の細胞成分との相互作用に基づいて同定することができる。ここで、我々はマルチスペクトル画像化とスペクトルアンミキシング方法論が続き、この多色·多細胞移植モデルの典型例として、腫瘍発生について説明します。 腫瘍の進行は、A、増殖の増強が含まれるいくつかの買収能力によってマークされている多段階プロセスであり、、ntiapoptotic侵襲及び血管新生特性図4腫瘍の開発は、成長因子、構造マトリックス、血管網および免疫調節を提供するために、周囲の環境中に動員される非腫瘍細胞によって促進される。1,5,6この微小生息域は由来細胞からなる局所、隣接例えば脂肪などの組織、および血管および骨髄由来細胞1と遠隔の供給源。非腫瘍細胞取り込みの程度は、多くの場合、腫瘍の病期/グレードに対応する腫瘍からの需要に依存している。腫瘍微小環境の支援の役割を理解するためには、非腫瘍細胞集団の起源と分化能を理解する必要があります。 このプロトコルは、細胞成分を、骨髄由来の両方の可視化を介して腫瘍の進行の解釈を助けるために設計され、局部組織DERIVされている細胞を編蛍光レポーター遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを利用して、我々は、致死的に照射RFP（赤色蛍光タンパク質）をマウスにGFP（緑色蛍光タンパク質）の骨髄を移植した。成功した骨髄移植に続いて、同系腫瘍細胞株を同所に注射し、4〜8週間のために移植するために許可されています。得られた腫瘍をマウスから切除し、間質の成分を可視化するために免疫蛍光染色（IF）のために処理される。多重マーカーIFはかなりの最適化7-9が含まれ、一般的に使用される技術である、しかし、マルチスペクトル画像/アンミキシング·プラットフォームを使用すると、スペクトルの重なりを持った蛍光マーカーの組み合わせの可能性を向上させます。ここに我々はMIMicc - マルチスペクトルセルラー起源を分析するために染色し、単一のスライド上の腫瘍セクション内の8のマーカーまでを分析するために多重化細胞組成の尋問、細胞分化ST呼ぶ手法を提示のATUと腫瘍微小環境内の構成要素の細胞 - 細胞相互作用。この簡単な例は、抗体を利用した5つ、6つ、またはそれ以上のマーカーまたは細胞内プロモーター駆動の蛍光発現。 表1考慮する適切な種との潜在的な蛍光抗体染色の組み合わせを分析するために、上に展開される可能性を有する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

複雑な組織の発達への複数の細胞要素の寄与を理解する欲求と、そのような多数の組織の再生に関与する細胞型、腫瘍形成、又は脈管形成などを、我々は、腫瘍発生の多色セルラ移植モデルを考案細胞集団は、異なる蛍光着色レポーター遺伝子マウスに由来し、移植された移植された又は現像腫瘍および周囲に注入される。これらの着色次いで、細胞を動員し、腫瘍間質に組み込まれる。定量的に骨髄由来の腫瘍間質細胞を評価するために、我々はIACUCによって承認されたマウスを致死的に照射RFP発現するトランスジェニック全骨髄を発現するGFPを移植した。同所移植したマウスに注射した0ovarian腫瘍移植後6〜8週間を切除し、腫瘍関連を検出するために、骨髄起源（GFP）のマーカーならびに抗体マーカーについて分析したマルチスペクトル画像化技術を使用して、間質。次に、定量的にセルがいるから（元レポーター遺伝子ラベルに基づいて）起動集団、および4、5の非混合する当社の能力として来たラベルかを評価するためにfluoroprobesのマルチスペクトルアンミキシングを使用して、我々が多重細胞組成のMIMicc - マルチスペクトル尋問呼び出す方法論を適応スライドあたりに6個以上のスペクトルは、精度を高めるために細胞系譜や分化に関連する追加の免疫組織化学を追加しました。共局在して多重化された蛍光信号を検出するためのソフトウェアを利用して、腫瘍間質集団は、トレースさ列挙マーカー染色に基づいて特徴付けすることができる。1

我々のトランスジェニックBMTマウスモデルにおいて移植された腫瘍を分析するためにマルチスペクトル画像化技術を使用して、我々は、骨髄起源である腫瘍間質成分を識別することができる。初期BMTは、フローサイトメトリー（ 図1）により、移植後三週間確認された。同所は、BMTの生着確認が最初の腫瘍注射後6週間を切除し、ホルマリンで固定し、次のラベルのない卵巣腫瘍?...

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Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

複雑な組織塊、器官からの腫瘍に、種々の細胞成分から構成されている。我々は、タンパク質の発現に基づいて細胞起源だけでなく、電池特性を解読するスペクトルアンミキシングに続くマルチパラメータ免疫蛍光染色と組み合わせたマルチ蛍光標識トランスジェニックマウスを利用して組織内の細胞の表現型の寄与を明らかにした。

細胞の起源、タイプ、および相互作用の可視化のための蛍光組織移植に続いて定量的マルチスペクトル解析

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

定量的な可視化と動的な熱画像を用いた皮膚癌の発見

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

組み合わせによるマウスのシングルセル解像度で肺転移の可視化の向上<em&gt;のin-situ</em肺組織とのX-gal染色の&gt;灌流<em&gt; lacZを</em&gt;タグ付き腫瘍細胞

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

事後組織から心筋細胞核の分離

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

病におけるクロマチンプロテオームの定量的解析

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

ネズミ異心臓移植技術

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

人間のてんかん術後皮質組織の多電極アレイ録音

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Murine Kidney Transplant Technique

マウスの腎臓移植​​技術

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

静脈介在モデル：バイパスグラフト開存を研究するための適切なモデル

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

マウスの腹部大動脈 Myointimal 過形成を誘導するために気球を利用した傷害

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...