Name: quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions
Uploaded: 2013-09-22T20:30:00
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우리는 박사 부부의 토론,지도와 지원에 감사드립니다. 마이클 Andreeff MD, 박사., 야렛 벅스 박사. MD 앤더슨 유동 세포 계측법 및 세포 이미징 핵심 시설에서. 이 작품은 FCM의 국립 암 연구소 (RC1-CA146381, CA-083639, R01NS06994, CA116199 및 CA109451에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다. ELS는 국방부 육군 부 (BC083397)에 의해 지원된다.

동계 쥐과 골수 이식 (BMT)는 기관 IACUC 프로토콜에 의해 승인 된 (주 :이 프로토콜의 성공은 멀티 스펙트럼 분석 대상으로 어떠한 라벨링 된 셀 타입 (들)의 이용을 필요로하고, 하류의 분석을 용이하게하기 위하여, 하나는 어떤 유전자를 이용할 수 또는 안정 세포 라벨링. 우리는 어떤 셀, 조직, 또는 기관 - 투 - 수 이식 모델과 연구가 유용하다고 생각 이식 등의 다양하고 독특한 레이?...

<ol>
	<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+the+tumor+microenvironment:+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma.">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563 (2012).</li><li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+(MSCs)+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects.">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li><li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type.">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li><li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992 (2009).</li><li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neighbors+and+distant+invaders:+Tumor-associated+niche+cells.">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+molecular+pathways+and+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li><li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections.">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li><li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections.">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13 (2008).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse.">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li></ol>

여기서 우리는 종양 미세 환경의 골수 유래 기질 성분을 분석하기 위해, 멀티 플렉스 셀룰러 조성물 MIMicc - 멀티 스펙트럼 심문으로 서술 멀티 스펙트럼 영상의 응용을 설명하지만 이러한 방법론과 개념은 복잡한 구도 다른 세포 성분을 해독에 적용될 수있다 이러한 상처 치유 반응 중 또는 재생 조직 중에 본 것과 같은 조직. 이 실험에서 우리는 형광 접목 종양 미세 환경 내의 호스트 유래 세포?...

조직 개발 및 수리를 이해하는 것은 상처 치유, 2,3 재생 의학, 발달 생물학, 종양 생물학에 참여하는 세포 구성 요소를 해명에 중요하다. 수리의 상황에서, 많은 종류의 세포는 혈관, ECM 증착, 확산 및 조직 구조 조정에 도움이 주변의 미세 환경에 침투. 셀룰러 요인과 표현형은 다 항목, 지역화를 식별 할 수있는 다중화 마커, 분화 상태와 조사 미세 환경 내 세포 성분 사이의 상호 작용을 기반으로 식별 될 수있다. 여기서, 우리는 다중 분광 영상과 스펙트럼 unmixing 방법론 다음이 여러 가지 빛깔의 - 다세포 이식 모델의 프로토 타입 예를 들어 종양의 발달을 설명합니다. 종양의 진행이 향상 확산을 포함 여러 인수 기능에 의해 표시되는 여러 단계의 과정이다, ntiapoptotic 침습적 혈관 속성은. 4 종양 개발은 성장 인자, 구조 행렬, 혈관 네트워크와 면역 변조를 제공하기 위해 주변 환경에 모집 비 종양 세포에 의해 촉진된다. 1,5,6이 microhabitat가에서 파생 된 세포로 구성 지역, 이웃 등 지방 등의 조직, 혈관 및 골수 유래 세포 1과 먼 소스. 비 종양 세포 결합의 정도는 종종 종양의 단계 / 등급에 해당하는 종양의 수요에 따라 달라집니다. 지지 종양 미세 환경의 역할을 이해하기 위해, 하나의 비종 양성 세포 집단의 기원과 분화 잠재력을 이해해야한다. 이 프로토콜은 로컬 티슈 변환 해주는 둘 골수 유래 세포 성분의 시각화를 통한 종양 진행의 해석을 돕기 위해 설계되었으며세포 에드. 형광 리포터 유전자를 발현하는 형질 전환 생쥐를 활용하여, 우리는 치명적 조사 RFP (적색 형광 단백질) 마우스로 GFP (녹색 형광 단백질)의 골수를 이식. 성공적인 골수 생착 다음, 동계 종양 세포주 orthotopically 주입 4-8 주간 생착시킨다. 그 결과 종양 마우스에서 절제와 기질 구성 요소를 시각화하는 면역 염색 (IF)에 처리됩니다. 다중 마커 그러나 스펙트럼 중복을 가지고 형광 마커의 조합에 대한 가능성을 향상시키는 다중 분광 영상 / unmixing 플랫폼을 사용하여, 상당한 최적화 7-9을 포함 일반적으로 사용되는 기술됩니다. 여기에서 우리는 우리가 세포의 기원, 세포 분화 성을 분석하기 위해 얼룩 하나의 슬라이드에 종양 섹션에있는 여덟 마커까지 분석하는 다중 세포 조성물을 MIMicc - 멀티 스펙트럼 심문 전화 기술을 제시ATUS와 종양 미세 환경 내에서 구성 요소의 세포 - 세포 상호 작용. 이 간단한 예는 항체를 이용하여 다섯, 여섯, 이상의 마커 또는 세포 내 프로 중심의 형광등 식입니다. 표 1은 고려 적절한 종의 잠재적 인 형광 항체 염색 조합을 분석하기 위해에 따라 확장 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

복합 조직의 발달로 여러 셀룰러 요소의 포스팅을 이해하는 욕망 등의 조직, 종양 형성 또는 혈관 생성의 재생에 참여할 다수의 세포 유형으로, 우리의 종양 발달의 멀티 셀룰러 이식 모델을 고안 세포 집단은 서로 다른 색깔의 형광 리포터 유전자 쥐에서 발생하고, 이식 접목 또는 개발 종양과 주위에 주입한다. 이러한 색깔의 세포는 다음 모집 종양 기질에 통합됩니다. 정량적으로 골수 유래의 종양 간질 세포를 평가하기 위하여, 우리는 IACUC 승인 한 생쥐를 발현 치명적 조사 RFP로 형질 전체 골수를 이식 GFP 발현. orthotopically 이식 된 생쥐에 주입했다 0ovarian 종양 6-8 주 포스트 생착을 절제 및 관련 종양을 감지하는 기원의 골수 마커 (GFP)뿐만 아니라 항체 마커 분석 하였다멀티 스펙트럼 화상 기술을 이용하여 기질. 우리는 그 양적 세포가있는 (원본 리포터 유전자 라벨 기준)부터 인구, 4, 5 unmix 할 수있는 능력과 함께 표시되는 평가하는 fluoroprobes의 멀티 스펙트럼 unmixing을 사용하여, 우리는 멀티 플렉스 세포 조성물의 MIMicc - 멀티 스펙트럼 심문 호출 방법을 적용 슬라이드 증가 당 6 개 이상의 스펙트럼, 우리는 세포 계통 또는 정밀도를 높이기 위해 분화와 관련된 추가 면역 조직 화학 염색을 추가했습니다. 공동화 다중 형광 신호, 종양의 기질 인구가, 추적 열거 마커 염색을 기준으로 특징 될 수있다을 감지하는 소프트웨어를 활용. 1

우리 형질 BMT 마우스 모델에서 종양 접목을 분석하는 멀티 스펙트럼 영상 기술을 사용하여, 우리는 골수 유래의 아르 간질 종양 성분을 식별 할 수있다. 초기 BMT는 유동 세포 계측법에 의해 3 주 후 이식 (그림 1)을 확인 하였다. Orthotopically는 BMT의 생착 확인서가 초기 종양 주사 다음 절제 포르말린이 육주 수정 된 다음과 같은 레이블이없는 난소 종양을 주입했다. 파라핀 종양 섹션은 &...

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Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

복잡한 조직 대중은 장기에서 종양, 다양한 세포 요소로 구성되어있다. 우리는 세포의 기원뿐만 아니라 단백질 발현에 따라 세포의 특성을 해독 스펙트럼 unmixing 다음 다중 매개 면역 형광 염색과 함께 멀티 라벨 형광 형질 전환 마우스를 이용한 조직 내에서 세포의 표현형의 기여를 밝혀.

세포의 기원, 종류, 그리고 상호 작용의 시각화를위한 형광 조직 이식에 따라 정량 멀티 스펙트럼 분석

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

양적 시각화 및 동적 써멀 이미징을 사용하여 피부암의 감지

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

연구

의학

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화<em&gt;에서 시츄</em폐 조직 및 X-걸의 착색의&gt; 재관류<em&gt; lacZ</em&gt; 태그 종양 세포

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

사후 조직에서 Cardiomyocyte 핵의 분리

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

질병의 염색질 Proteomes의 정량 분석

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

쥐 이소성 심장 이식 기술

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

인간의 간질 수술 후 두피 조직의 다중 전극 어레이 레코딩

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Murine Kidney Transplant Technique

쥐 신장 이식 기술

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

정맥 삽입 위치 모델 : 바이 패스 이식 개통을 연구하기위한 적절한 모델

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

풍선-기반 부상 마우스 복 부 대동맥에서 Myointimal 증식을 유도 하

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...