Name: quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions
Uploaded: 2013-09-22T20:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions at JoVE.com

Vi er takknemlige til diskusjoner, veiledning og støtte fra legene. Michael Andreeff MD, PhD., Og Jared Burks PhD. fra MD Anderson flowcytometri og Cellular Imaging Core Facility. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra National Cancer Institute (RC1-CA146381, CA-083 639, R01NS06994, CA116199 og CA109451 for FCM. ELS er også støttet av hæren Department of Defense (BC083397).

Syngene Murine benmargstransplantasjon (BMT) som er godkjent av institusjonelle IACUC protokoller (Merk: Suksess for denne protokollen krever utnyttelse av eventuelle merket celletype (r) som mål for multispektrale analyse, og å legge til rette for nedstrøms analyse, kan man utnytte noen genetiske eller stabil cellemerking. Vi foreslår at en hvilken som helst celle, vev eller organ-å-være kan påføres på et transplantat modell og at transplantatet kan inneholde så mange unike merkede populasjon...

<ol>
	<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+the+tumor+microenvironment:+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma.">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563 (2012).</li><li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+(MSCs)+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects.">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li><li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type.">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li><li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992 (2009).</li><li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neighbors+and+distant+invaders:+Tumor-associated+niche+cells.">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+molecular+pathways+and+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li><li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections.">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li><li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections.">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13 (2008).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse.">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li></ol>

Heri beskriver vi anvendelse av multispektrale avbildning vi beskrive som MIMicc-multispektrale utspørring av Multiplexed cellulære sammensetninger, for å analysere de benmarg avledet stromale komponenter i tumor mikromiljøet, men denne metodikk og konsept kan benyttes til å tolke andre cellulære elementer som utgjør et komplekst vev som de sett under sårtilheling reaksjoner eller under en regenerativ vev. I disse forsøk benytter vi transgene mus for å fluorescensmerket skille de benmargceller avledet fra vert...

Forstå vev utvikling og reparasjon er viktig å belyse deltar cellulære komponenter i sårheling, 2,3 regenerativ medisin, utviklingsbiologi og tumorbiologi. Under omstendighetene reparasjon, mange celletyper infiltrere omkringliggende mikromiljøet til hjelp i vascularization, ECM deponering, spredning og vev restrukturering. Cellulære faktorer og fenotyper kan identifiseres basert på multiparameter, multipleksede markører som kan identifisere lokalisering, differensiering status og samhandling mellom cellulære komponenter innenfor undersøkt mikromiljøet. Heri beskriver vi tumor utvikling som en prototypisk eksempel på dette flerfarget-flercellet transplantasjon modellen etterfulgt av multispektrale bildebehandling og spektral unmixing metodikk. Tumorprogresjon er en flertrinns prosess som er preget av flere oppkjøpte funksjoner som omfatter økt spredning, enntiapoptotic, invasive og angiogenetiske egenskaper. 4 Tumor utvikling er tilrettelagt av ikke-neoplastiske celler som er rekruttert inn i det omkringliggende miljø for å gi vekstfaktorer, strukturelle matriser, vaskulære nettverk og immunmodulering. 1,5,6 Denne mikrohabitat består av celler som stammer fra lokale, nabo vev som adipose, og blodårer og fjerne kilder som for eksempel benmarg avledet celler en. Graden av ikke-neoplastisk celle inkorporering avhenger av etterspørselen fra tumoren, noe som ofte er den samme som fasen / karakteren av svulsten. For å forstå rollen av svulsten støttende mikromiljøet, må man forstå opprinnelsen og differensiering potensial av de ikke-neoplastiske cellepopulasjoner. Denne protokoll er blitt utviklet for å hjelpe til med forståelsen av tumor progresjon gjennom visualisering av både benmarg avledet cellulære komponenter, og det lokale vevet derived celler. Utnytte fluorescerende reporter gen-uttrykke transgene mus, transplantert vi GFP (green-fluorescerende protein) benmarg til en lethally bestrålt RFP (red-fluorescerende protein) mus. Etter vellykket benmarg engraftment, er en syngene tumor cellelinje injisert orthotopically og lov til å innpode i 4-8 uker. Den resulterende tumor er fjernet fra musen og behandlet for immunofluorescent (IF) farging for å visualisere de stromale komponenter. Multipleksing IF markører er en vanlig brukt teknikk som innebærer betydelig optimalisering 7-9, men ved hjelp av en multispektrale avbildning / unmixing plattformen øker potensialet for fluoriserende fargestoff kombinasjoner som besitter spektral overlapping. Heri vi presentere en teknikk vi kaller MIMicc-multispektrale avhør av multiplekskanaler cellulære komposisjoner å farge og analysere opptil åtte markører innenfor en svulst seksjon på et enkelt lysbilde for å analysere de cellulære opprinnelse, cellulær differensiering stAtus og celle-celle interaksjoner av komponenter innenfor tumormikromiljøet. Dette forenklet eksempel har potensial til å bli utvidet på for å analysere fem, seks eller flere markører utnytte antistoffer eller intracellulær promoter-drevet fluorescerende uttrykk. Tabell 1 lister potensielle fluorescerende antistoffarging kombinert med egnede arter tatt i betraktning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

Med ønske om å forstå bidragene fra flere cellulære elementer til å utvikle et sammensatt vev, slik som de tallrike celletyper som deltar i regenererende vev, tumordannelse, eller vaskulogenese, har vi utviklet en flerfarget celletransplantasjonsmodell for tumorutvikling som cellepopulasjoner stammer fra forskjellige fluorescently fargede reporter gen mus og er transplantert, innpodet eller injiseres i og rundt et utviklings svulst. Disse fargede cellene blir deretter rekruttert og inkorporert inn i svulsten stroma. For å kvantitativt vurdere benmarg avledet stromale tumorceller, transplantert vi GFP uttrykker transgene hele benmarg inn lethally bestrålt RFP uttrykke mus som er godkjent av IACUC. 0ovarian svulster som ble orthotopically injisert i de transplanterte musene ble skåret i 6-8 uker etter engraftment og analysert for benmargs markør utstedt (GFP), så vel som antistoff-markører for å påvise tumor assosiertstroma bruker multispektrale bildeteknikker. Vi deretter tilpasset en metode vi kaller MIMicc-Multispectral Avhør av multiplekskanaler cellulære komposisjoner, ved hjelp av multispektrale unmixing av fluoroprobes til kvantitativt vurdere hvilke merket celle kom fra hvilke start populasjoner (basert på originale reporter gen etiketter), og som vår evne til å unmix 4, 5 , 6 eller flere spektra per lysbilde øker, har vi lagt ekstra immunhistokjemi forbundet med celle linjene eller differensiering for å øke presisjonen. Utnytte programvare for å oppdage samlokalisert multipleksede-fluorescerende signaler, svulst stromal populasjoner kan spores, oppregnet og preget basert på markør farging. 1

Ved hjelp av en multispektrale avbildningsteknikk å analysere svulster innpodet i vår transgen BMT mus modell, er vi i stand til å skjelne stromal tumor komponenter som er av benmargen opprinnelse. Den innledende BMT ble bekreftet tre uker etter transplantasjonen ved strømningscytometri (figur 1). Orthotopically injisert umerkede ovarietumorer følgende BMT engraftment bekreftelser ble skåret ut og formalinfiksert seks uker etter innledende svulst injeksjon. Parafin innebygd tumor delene ble seksjo...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions at JoVE.com

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Komplekse vev massene, av organer til tumorer, er sammensatt av forskjellige cellulære elementer. Vi belyst bidrag av cellulære fenotyper i en vev utnytte multi-merket fluorescerende transgene mus i kombinasjon med multiparameter immunofluorescent flekker etterfulgt av spektral unmixing å dechiffrere celle opprinnelse samt celleegenskaper basert på protein uttrykk.

Kvantitativ Multispectral Analyse Etter Fluorescent Tissue Transplant for visualisering av Cell Origins, Typer, og interaksjoner

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Forbedret Visualisering av lungemetastaser ved Single Cell Oppløsning i Mus med Kombinert<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusjon av lungevev og X-Gal Farging av<em&gt; LacZ</em&gt;-Merket tumorceller

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolering av Cardiomyocyte kjerner fra Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

Kvantitativ analyse av Chromatin Proteomes i sykdom

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

Murint Heterotop hjertetransplantasjon Teknikk

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Multi-elektrode Array Recordings of Human Epileptiske Postoperativ Kortikal Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Murine Kidney Transplant Technique

Muse Kidney Transplant Technique

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Vein Interposisjon Modell: En passende modell for å studere Bypass Graft åpenhet

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kvantitativ visualisering av leukocytinfiltrat i en murin modell av Fulminant myokarditt ved lysarkmikroskopi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

Ballong-baserte skade å indusere Myointimal Hyperplasia i musen Abdominal Aorta

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...