Name: quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions
Uploaded: 2013-09-22T20:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions at JoVE.com

Мы благодарны обсуждений руководством и при поддержке доктора. Майкл Andreeff MD, PhD., И Джаред Беркс кандидат. от MD Anderson проточной цитометрии и визуализации клетки основной комплекс. Эта работа была частично поддержана грантами от Национального института рака (RC1-CA146381, CA-083639, R01NS06994, CA116199 и CA109451 для ТСМ. ELS также поддерживается армии Министерства обороны (BC083397).

Сингенная мышиный Пересадка костного мозга (ТКМ), утвержденного институциональных протоколов IACUC (Примечание: Успех этого протокола требуется использование любой надписью типа (типов) клеток в качестве цели для мультиспектральных анализа, а также содействовать потоку анализ...

<ol>
	<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+the+tumor+microenvironment:+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma.">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563 (2012).</li><li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+(MSCs)+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects.">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li><li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type.">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li><li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992 (2009).</li><li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neighbors+and+distant+invaders:+Tumor-associated+niche+cells.">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+molecular+pathways+and+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li><li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections.">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li><li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections.">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13 (2008).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse.">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li></ol>

Здесь мы опишем применение мультиспектральных изображений мы описываем как MIMicc-многоспектрального допроса мултиплексу сотовых композиций, проанализировать костного мозга стромальных компонентов микросреды опухоли, однако эта методология и концепция может быть применена к расшифр...

Понимание развития и восстановления тканей имеет важное значение для выяснения, участвующих клеточные компоненты в заживлении ран, 2,3 регенеративной медицины, биологии развития и биологии опухоли. В условиях ремонта, многочисленные типы клеток проникнуть в окружающую микросреду, чтобы помочь в васкуляризации, осаждения ECM, пролиферации и реструктуризации ткани. Клеточные факторы и фенотипы могут быть определены на основе многопараметрических, мультиплексированных маркеров, которые могут идентифицировать локализацию, состояние дифференциации и взаимодействия между клеточными компонентами в пределах исследуемого микросреды. Здесь мы описываем развитие опухоли как прототип, например, для этого многоцветного-многоклеточные модели трансплантации последующим мультиспектральных изображений и спектрального методологии несмешивания. Прогрессия опухоли является многоэтапный процесс, который характеризуется несколько приобретенных возможностей, которые включают повышенную пролиферацию, а,ntiapoptotic, инвазивные и ангиогенные свойства. 4 Развитие опухоли способствует неопухолевых клеток, которые набранных в окружающую среду, чтобы обеспечить факторы роста, структурные матрицы, сосудистых сетей и иммунную модуляцию. 1,5,6 Это микросреда состоит из клеток, полученных из местные, соседние ткани, такие как жировой, и кровеносные сосуды и далекие источники, такие как костного мозга, полученных клеток 1. Степень неопухолевых включения клеток зависит от спроса со стороны опухоли, которая часто соотносится с этапа / сорта опухоли. Чтобы понять роль опухоли поддерживающей микросреды, нужно понять происхождение и дифференциации потенциал населения неопухолевых клеток. Этот протокол был разработан, чтобы помочь в интерпретации опухолевой прогрессии через визуализации обеих костного мозга, полученных клеточных компонентов, и местные DERIV тканиред клетки. Используя флуоресцентные репортер генов, экспрессирующих трансгенных мышей, мы пересадили GFP (зеленый-флуоресцентный белок) костного мозга в летально облученных RFP (красно-флуоресцентный белок) мыши. После успешного приживления костного мозга, сингенными линия клеток опухоли вводится ортотопически и позволило привить в течение 4-8 недель. В результате опухоль вырезали из мыши и обработаны для иммунофлуоресцентного (ИФ) окрашивания для визуализации стромальных компонентов. Мультиплексирование ЕСЛИ маркеры является широко используемым методом, который включает в себя значительную оптимизацию 7-9, однако с использованием мультиспектральных изображений / несмешивания платформу улучшает потенциал для люминесцентных комбинаций маркеров, которые обладают спектральной перекрытие. Здесь мы представляем технику мы называем MIMicc-мультиспектральный допрос мултиплексу сотовых композиций для окрашивания и анализировать до восьми маркеров в рамках секции опухоли на одном слайде для анализа клеточных происхождение, клеточной дифференцировки улАТУС и межклеточные взаимодействия компонентов внутри микросреды опухоли. Это упрощенный пример имеет потенциал, чтобы быть расширена на для анализа пять, шесть или более маркеров, использующие антитела или внутриклеточная промоутер управляемой люминесцентные экспрессии. В таблице 1 приведены потенциальные люминесцентные комбинаций окраски антитела с соответствующими видами учитывать.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

С желанием понять вклад нескольких клеточных элементов в развитие сложной ткани, такие, как многочисленных типов клеток, участвующих в регенерации ткани, образование опухолей, или васкулогенез, мы разработали разноцветные сотовой трансплантата модель развития опухоли у которые популяции клеток происходят из различных флуоресцентно цветных гена-репортера мышей и пересаживают, привиты или вводят в и вокруг развивающейся опухоли. Эти цветные клетки затем на работу и включены в строме опухоли. Для того, чтобы количественно оценить костного мозга стромальные клетки опухоли, мы трансплантировали GFP выражения трансгенного весь костный мозг летально облученных в RFP, экспрессирующих мышей, утвержденной IACUC. 0ovarian опухоли, которые были ортотопически вводили в трансплантированных мышей вырезали 6-8 недель после приживления и анализировали на маркера костного мозга происхождения (GFP), а в качестве маркеров для выявления антител, ассоциированных с опухольюстромы с помощью мультиспектральных методов визуализации. Затем мы адаптировали методику мы называем MIMicc-Мультиспектральный Допрос мултиплексу сотовых композиций, используя мультиспектральных расслоении fluoroprobes количественно оценить, какие помечены ячейки пришли из которых, начиная населения (на основе оригинальных гена-репортера этикеток), и, как нашей способности unmix 4, 5 , 6 или более спектры в увеличении слайд, мы добавили дополнительную иммуногистохимию связанный с клеточных клонов или дифференциации повышения точности. Используя программное обеспечение для обнаружения совместно локализованные уплотненные-люминесцентные сигналы, популяции стромальных опухолей можно проследить, перечисленные и характеризующиеся на основе окрашивания маркера. 1

Использование мультиспектральных метод воображения для анализа опухолей насаждаемое в нашей трансгенной модели ТКМ мыши, мы можем различить стромальных компонентов опухоли, которые происхождения костного мозга. Первоначальный БМТ было подтверждено три недели после трансплантации ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions at JoVE.com

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Сложные массы ткани, из органов к опухолям, состоят из различных клеточных элементов. Мы выяснены вклад сотовых фенотипов в ткани с использованием мульти-меченых флуоресцентными трансгенных мышей в сочетании с окрашиванием многопараметрических иммунофлуоресцентным последующим спектральным несмешивания расшифровать клеток происхождение, а также характеристики клеток, основанные на экспрессии белка.

Количественный Мультиспектральный Анализ После Люминесцентная трансплантации тканей для визуализации клеточных Origins, типы и взаимодействий

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

Количественная визуализация и обнаружение рака кожи с использованием динамических Тепловизор

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Улучшена визуализация метастазов в легких на одной резолюции сотовый у мышей, комбинированные<em&gt; В месте</em&gt; Перфузии легочной ткани и X-Gal Окрашивание<em&gt; LacZ</em&gt;-Меткой опухолевых клеток

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Выделение ядер кардиомиоцитов с Посмертные тканей

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

Количественный анализ хроматина протеомов в болезнь

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

Мышиные Гетеротопическая пересадке сердца Техника

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Многоэлектродной массива Записи человека эпилептические Послеоперационный корковой ткани

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Murine Kidney Transplant Technique

Мышиные трансплантации почек Техника

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Жила интерпозиция Модель: A Подходит модель для изучения шунтирование проходимость

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Количественная визуализация инфильтрата лейкоцитов в мышиной модели фульминантного миокардита методом микроскопии легких листов

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

На основе шар травмы побудить Myointimal гиперплазии в мыши брюшной аорты

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...