Name: quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions
Uploaded: 2013-09-22T20:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions at JoVE.com

Vi är tacksamma för diskussioner, vägledning och stöd från Dr. Michael Andreeff MD, PhD., Och Jared Burks PhD. från MD Anderson flödescytometri och Cell Imaging Core Facility. Detta arbete stöddes delvis av anslag från National Cancer Institute (RC1-CA146381, CA-083.639, R01NS06994, CA116199 och CA109451 till FCM. ELS stöds också av armén försvarsdepartementet (BC083397).

Syngent Murina benmärgstransplantation (BMT) som har godkänts av institutionella IACUC protokoll (Obs: Framgång för detta protokoll kräver användning av det märkta celltyp (ar) som mål för multispektrala analys, och för att underlätta den efterföljande analysen, man kan utnyttja någon genetisk eller stabil cellmärkning. Vi föreslår att alla celler, vävnader eller organ-till-vara kan tillämpas på ett transplantationsmodell och att transplantationen kan innehålla så många unika märk...

<ol>
	<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+the+tumor+microenvironment:+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma.">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563 (2012).</li><li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+(MSCs)+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects.">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li><li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type.">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li><li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992 (2009).</li><li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neighbors+and+distant+invaders:+Tumor-associated+niche+cells.">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+molecular+pathways+and+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li><li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections.">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li><li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections.">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13 (2008).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse.">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li></ol>

Häri beskriver vi tillämpningen av multispektrala avbildning vi beskriver som MIMicc-multispektral förhör av Multiplexad cellulära kompositioner, för att analysera de benmärg härledda stromaceller komponenterna tumormicroenvironmenten emellertid denna metod och koncept kan appliceras på dechiffrera andra cellulära element som utgör en komplex vävnader, såsom de som ses under sårläkning reaktioner eller under en regenerativ vävnad. I dessa experiment använder vi transgena möss för att fluorescens särs...

Förstå vävnadsutveckling och reparation är viktigt att belysa deltar cellkomponenter i sårläkning, 2,3 regenerativ medicin, utvecklingsbiologi och tumörbiologi. Under omständigheterna reparation, många celltyper infiltrera omgivande mikromiljö till stöd i vaskularisering, ECM nedfall, spridning och omstrukturering vävnad. Cellulära faktorer och fenotyper kan identifieras utifrån multi, multiplexade markörer som kan identifiera lokaliseringen, differentieringsstatus och interaktion mellan cellkomponenter inom det undersökta mikromiljö. Häri beskriver vi tumörutveckling som en prototypiska exempel för denna multicolor-flercellig transplantationsmodell följt av multispektrala avbildning och spektral unmixing metodik. Tumörprogression är en flerstegsprocess som präglas av flera förvärvade förmågor som inkluderar förbättrad spridning, enntiapoptotic, invasiva och angiogena egenskaper. fyra Tumör utveckling främjas av icke-neoplastiska celler som rekryteras till den omgivande miljön för att ge tillväxtfaktorer, strukturella matriser, vaskulära nätverk och immunmodulering. 1,5,6 Denna microhabitat består av celler som härrör från lokal, angränsande vävnader såsom fett, och blodkärl och avlägsna källor såsom benmärg härledda celler 1. Omfattningen av icke-neoplastisk cell inkorporering beror på efterfrågan från tumören, vilket ofta motsvarar scenen / grad av tumören. För att förstå betydelsen av tumören stödjande mikromiljö, måste man förstå ursprunget och differentieringspotentialen av de icke-neoplastiska cellpopulationer. Detta protokoll har utformats för att hjälpa till vid tolkning av tumörprogression genom visualisering av både benmärg härledda cellkomponenter, och den lokala vävnads derived celler. Med hjälp av fluorescerande reporter gen-uttryckande transgena möss, transplanterade vi GFP (grönt fluorescerande protein) benmärg i ett dödligt bestrålat RFP (röd-fluorescerande protein) mus. Efter lyckad benmärgs engraftment, är en syngent tumörcellinjen injiceras orthotopically och får ympas i 4-8 veckor. Den resulterande tumören skärs ut från musen och bearbetades för immunofluorescens (IF)-färgning för att visualisera de stromala komponenter. Multiplexing IF markörer är en vanligt förekommande teknik som innebär betydande optimering 7-9, men med hjälp av en multispektrala avbildning / unmixing plattform förbättrar potentialen för fluorescerande markörkombinationer som besitter spektral överlappning. Häri presenterar vi en teknik som vi kallar MIMicc-multispektrala förhör av Multiplexade cellulära kompositioner för att färga och analysera upp till åtta markörer inom en tumör avsnitt om en enda bild för att analysera de cellulära ursprung, celldifferentiering stparater och cell-cell interaktioner av komponenter inom tumormicroenvironmenten. Denna förenklade exempel har potential att byggas ut på för att analysera fem, sex eller fler markörer som använder antikroppar eller intracellulär promotor-driven fluorescerande uttryck. Tabell 1 listar potentiella fluorescerande antikroppsfärgnings kombinationer med lämpliga arter beaktas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

Med en önskan att förstå bidragen från flera cellulära element för utvecklingen av en komplex vävnad, till exempel de många celltyper som deltar i regenerera vävnad, tumörbildning, eller vaskulogenes, vi utarbetat en flerfärgad celltransplantationsmodell för tumörutveckling i vilken cellpopulationer kommer från olika fluorescerande färgade reporter gen möss och transplanteras, engrafted eller injiceras i och kring en utveckling av tumör. Dessa färgade celler sedan rekryteras och införlivas i tumören stroma. För att kvantitativt bedöma benmärg härledda tumör stromaceller, transplanterade vi GFP uttrycka transgena hel benmärg in i dödligt bestrålade RFP uttrycka möss som godkänts av IACUC. 0ovarian tumörer som ortotopiskt injiceras i de transplanterade mössen exciderades 6-8 veckor efter inympning och analyserades för benmärgs markör av ursprung (GFP) samt markörer antikropp för att detektera tumörassocieratstroma med hjälp av multispektrala avbildningstekniker. Vi anpassade då en metod som vi kallar MIMicc-Multispectral Förhör av Multiplexad cellulära kompositioner, med hjälp av multispektrala unmixing av fluoroprobes att kvantitativt bedöma vilka märkta cellen kom från vilken start populationer (baserat på ursprungliga reporter gen etiketter), och som vår förmåga att unmix 4, 5 , 6 eller fler spektra per slide ökar, har vi lagt till ytterligare immunhistokemi i samband med cellhärstamningar eller differentiering för att öka precisionen. Använda programvara för att upptäcka co-lokaliserade multiplexade-fluorescerande signaler, tumör stromal populationer kan spåras, räknas och karaktäriseras utifrån markör färgning. 1

Med hjälp av en multispektrala bildteknik för att analysera tumörer engrafted i vår transgena BMT musmodell, kan vi urskilja stromal tumör komponenter som är av benmärgs ursprung. Den initiala BMT bekräftades tre veckor efter transplantation genom flödescytometri (figur 1). Orthotopically injicerade omärkta äggstockstumörer efter BMT transplantations bekräftelser skars ut och formalin fast 6 veckor efter initial tumörinjektion. Paraffin inbäddad tumörsektioner snittades i &lt;8 ìm skivo...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions at JoVE.com

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Komplexa vävnadsmassor, från organ till tumörer, består av olika cellulära element. Vi klar bidrag cellulära fenotyper inom en vävnad som använder multi-märkta fluorescerande transgena möss i kombination med multi immunofluorescens färgning följt av spektral unmixing att dechiffrera cell ursprung samt cellernas egenskaper baserade på proteinuttryck.

Kvantitativ Multispectral Analys Efter Lysrör Tissue Trans för visualisering av Cell Origins, typer, och interaktioner

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

Kvantitativa Visualisering och detektion av hudcancer Använda dynamiska Värmekameror

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Förbättrad Visualisering av lungmetastaser på Single Cell Upplösning i möss i Kombinerade<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusion av lungvävnad och X-gal-färgning av<em&gt; LacZ</em&gt;-Taggade tumörceller

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolering av kardiomyocetisk Kärnor från Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

Kvantitativ analys av kromatin proteom vid sjukdom

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

Murina Heterotopisk Heart Transplant Teknik

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Multi-elektrod Array Inspelningar av Human Epileptic Postoperativ kortikalvävnad

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Murine Kidney Transplant Technique

Murin njurtransplantation Teknik

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Ven mellan Modell: en lämplig modell för att studera bypass öppenhet

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kvantitativ visualisering av leukocytinfiltrat i en murinmodell av Fulminant-myokardit genom ljusarkmikroskopi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

Ballong-baserade skada att inducera Myointimal hyperplasi i mus bukaorta

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...