Name: quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions
Uploaded: 2013-09-22T20:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions at JoVE.com

Biz Dr gelen tartışmalar, rehberlik ve destek için müteşekkiriz. Michael Andreeff MD, PhD., Ve Jared Burks Doktora. MD Anderson Sitometrisi ve Hücresel Görüntüleme Çekirdek Tesisinden. Bu çalışma FCM için Ulusal Kanser Enstitüsü (RC1-CA146381, CA-083.639, R01NS06994, CA116199 ve CA109451 hibe kısmen desteklenmiştir. ELS ayrıca Savunma Ordusu Bölümü (BC083397) tarafından desteklenmektedir.

Singeneik Fare Kemik İliği Transplantasyon (KİT) kurumsal IACUC protokolleri tarafından onaylanan (Not: Bu protokolün Başarı bantlı analizi için hedef olarak etiketli bir hücre tipi (ler) kullanımını gerektirir ve aşağı analizini kolaylaştırmak için, bir herhangi bir genetik yararlanabiliriz veya sabit hücresel etiketleme. Biz herhangi bir hücre, doku veya organ-to-be, bir transplant model ve araştırma yararlı gördüğü nakli gibi birçok etiketlenmiş popülasyonları içerebi...

<ol>
	<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+the+tumor+microenvironment:+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma.">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563 (2012).</li><li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+(MSCs)+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects.">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li><li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type.">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li><li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992 (2009).</li><li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neighbors+and+distant+invaders:+Tumor-associated+niche+cells.">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+molecular+pathways+and+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li><li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections.">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li><li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections.">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13 (2008).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse.">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li></ol>

Burada biz tümör mikro-ortamınm kemik iliğinden elde edilen stromal bileşenleri analiz için, Çoklanmış hücresel bileşimlerin MIMicc-bantlı sorgulama olarak tanımlamak multispektral görüntüleme uygulanmasını açıklar, ancak bu yöntem ve kavram bir kompleks oluşturmak için diğer hücre öğeleri deşifre uygulanabilir Bu tür yara iyileşme reaksiyonlar sırasında veya rejeneratif doku gözlenenlere gibi dokuların. Bu deneylerde, floresan bir engrafted tümör mikro içinde konakçı hücrelerden ...

Doku gelişimini ve onarımını anlama yara iyileşmesi, 2,3 rejeneratif tıp, gelişim biyolojisi ve tümör biyolojisi katılan hücresel bileşenlerini anlamak önemlidir. Tamir şartlar altında, çok sayıda hücre türleri vaskülarizasyon, ECM birikimi, proliferasyon ve doku yeniden yardımcı olmak için çevreleyen mikro sızmak. Hücresel faktörler ve fenotipleri multiparametre, yerelleştirme belirleyebilir multiplexed belirteçler, farklılaşma durumu ve incelenen mikro içindeki hücresel bileşenleri arasındaki etkileşime dayalı tespit edilebilir. Bu yazıda, çok bantlı görüntüleme ve spektral Karışmama metodoloji ardından bu renkli-hücreli nakli model için bir prototip örnek olarak tümör gelişimini betimler. Tümör ilerlemesi gelişmiş çoğalması, a dahil birçok edinilen yetenekleri ile işaretlenir çok aşamalı bir süreçtir, ntiapoptotic, istilacı ve anjiyojenik özellikleri. 4 tümör gelişimi büyüme faktörleri, yapısal matrisler, vaskular ağlar ve bağışıklık modülasyon sağlamak için çevreye alınırlar neoplastik olmayan hücreler tarafından kolaylaştırılır. 1,5,6 Bu microhabitat türetilen hücrelerden oluşur yerel, komşu gibi adipoz gibi dokular ve kan damarları ve kemik iliği kökenli hücreler 1 olarak uzak kaynakları. Neoplastik olmayan hücre katılımı bir şekilde, genellikle, tümörün sahne / türü ile karşılık gelen tümör, gelen talebe bağlıdır. Tümör destekleyici mikroçevresinin rolünü kavramak için, bir non-neoplastik hücre popülasyonlarının kökeni ve farklılaşma potansiyelini anlamak gerekir. Bu protokol, lokal doku Türe de kemik iliğinden elde edilen hücre bileşenlerinin görselleştirme yoluyla tümör progresyonu yorumuna yardımcı olmak için tasarlanmıştır ve edilmiştirhücreler ed. Flüoresan raportör geni ifade eden transgenik fareler kullanarak, bir ölümcül ışınlanmış RFP (kırmızı flüoresan protein) fare içine, GFP (yeşil floresan protein), kemik iliği nakli. Başarılı kemik iliği engraftment ardından, sinjenik tümör hücre çizgisi orthotopically enjekte edilmiş ve 4-8 hafta boyunca sokmak bırakılır. Elde edilen tümör fareden çıkarıldı ve stromal bileşenleri görselleştirmek için boyama immunofloresans (IF) için işlenir. Çoklayıcı belirteçler ancak spektral örtüşme sahip floresan işaretleyici kombinasyonları için potansiyelini artırır bir çok bantlı görüntüleme / Karışmama platformunu kullanarak, anlamlı optimizasyon 7-9 içeren yaygın olarak kullanılan bir tekniktir IF. Bu yazıda biz hücresel kökeni, hücresel farklılaşma st analiz etmek için leke ve tek bir slayt üzerinde bir tümör bölüm içinde sekiz belirteçleri kadar analiz Çoklanmış hücresel kompozisyonlar MIMicc-çokbantlı sorgulama dediğimiz bir teknik mevcutATUS ve tümörün mikro-ortamı içinde parçalar, hücre-hücre etkileşimleri. Bu, basit bir örnek, antikorların kullanıldığı beş, altı veya daha fazla hücre içi işaretleri ya da promotör-tahrikli floresan ifadesi. Tablo 1, dikkate alınan uygun türleri, potansiyel bir floresan antikor boyama kombinasyonu analiz etmek amacıyla, üzerine genişletilmiş potansiyeline sahiptir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

Karmaşık doku gelişimine çoklu hücresel elemanların katkıları anlamak için arzusu ile, bu tür doku, tümör oluşumu veya vaskülojenez yenileyici katılmak çok sayıda hücre türleri olarak biz tümör gelişme çok renkli bir hücre transplant modeli geliştirmiştir hücre popülasyonlarının farklı renkli flüoresan raportör gen farelerden kaynaklanan ve transplant engrafted veya gelişmekte olan bir tümör içinde ve çevresinde enjekte edilmektedir. Bu renkli hücreler daha sonra alınmış ve tümör stromasında dahil edilmiştir. Nicel olarak, kemik iliği kaynaklı tümör stromal hücreleri değerlendirmek amacıyla, IACUC onaylı olarak farenin ifade ölümcül ışınlanmış RFP transgenik bütün kemik iliği nakli GFP sentezleyen. Orthotopically nakledilen farelere enjekte edilmiştir 0ovarian tümörler 6-8 hafta sonra bütünleşmesini kesilmiş ve ilgili tespit etmek için tümör kaynaklı kemik iliği işaretleyici (GFP) yanı sıra, antikor belirteçler için analiz edildibantlı görüntüleme teknikleri kullanılarak stroma. Biz o zaman nicel hücre hangi (orijinal raportör gen etiketlere dayalı) başlayan nüfus, ve 4, 5 unmix bizim yeteneği gibi geldi etiketlenmiş hangi değerlendirmek için fluoroprobes multispektral Karışmama kullanarak, biz Çoklanmış hücresel kompozisyonlar MIMicc-Çokspektrumlu Sorgulama dediğimiz bir metodoloji adapte , slayt artar başına 6 ya da daha fazla spektrumları, biz hücre soyları ya da hassasiyeti arttırmak için farklılaşma ile ilişkili ek immunhistokimya ekledik. Ko-lokalize multipleksli-floresan sinyalleri, tümör stromal nüfus, takip numaralandırılmış ve işaretleyici boyama dayalı karakterize edilebilir algılamak için yazılım kullanmak. 1

Bizim transgenik fare modelinde BMT engrafted tümörleri analiz etmek için bir çok bantlı görüntüleme tekniği kullanarak, kemik iliği kökenli stromal tümör bileşenleri ayırt edebiliyoruz. İlk BMT akış sitometri ile üç hafta post-transplant (Şekil 1) doğrulandı. Ortotopikal BMT melezleme teyit İlk tümör enjeksiyonunu takip eden kesilmiş ve formalin 6 hafta sabitlendi aşağıdaki etiketlenmemiş yumurtalık tümörleri enjekte edilir. Parafin tümör bölümleri &lt;8 mikron dil...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions at JoVE.com

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Kompleks doku kitleleri, organlardan tümörler, çeşitli hücresel elemanların oluşmaktadır. Bu hücre köken hem de protein ekspresyonu göre hücre özelliklerini deşifre spektral unmixing ardından çok parametreli immünofloresan boyama ile bir arada çok etiketli floresan transgenik fareler kullanılarak bir doku içinde hücre fenotipleri katkısını açıklanacaktır.

Hücre Origins, Türleri ve Etkileşimler Görselleştirme için Floresan Doku Nakli ardından Kantitatif Çokspektrumlu Analizi

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

Kantitatif Görselleştirme ve Dinamik Termal Görüntüleme Deri Kanseri Tespiti

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme<em&gt; In-situ</emAkciğer Doku ve X-Gal Boyanma&gt; Perfüzyon<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tümör Hücreleri

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

Mürin Heterotopik Kalp Nakli Tekniği

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

İnsan Epileptik Ameliyat sonrası Kortikal Doku Çok elektrot Dizi Kayıtlar

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Murine Kidney Transplant Technique

Murin Böbrek nakli Tekniği

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Ven interpozisyonu Model: baypas açıklığının Eğitim için uygun bir model

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

Fare Abdominal aort Myointimal Hiperplazi ikna etmek için balon tabanlı yaralanma

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...