Name: correlative microscopy for 3d structural analysis of dynamic interactions
Uploaded: 2013-06-24T13:00:00
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Os autores gostariam de agradecer Travis Wheeler ea loja de máquina do Departamento de Biologia Celular e Fisiologia da Universidade de Pittsburgh para a construção do palco amostra crio-fluorescência, Changlu e Tao Cheng Xu, da Universidade de Ciência e Tecnologia da China para técnico assistência, e Dr. Teresa Brosenitsch para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (GM082251 &amp; GM085043).

1. Cultura de células HeLa em revestido de carbono, EM Localizador Grids ouro <ol><li> Descarga luminescente do lado de carbono de um R2 de 200 mesh / 2 Quantifoil ouro EM localizador grade com menos de 25 mA para 25 seg. </li><li> Brasão da grade EM com fibronectina, flutuando-lo, do lado do carbono para baixo, em uma gota de 40 mL de 50 mg / ml solução fibronectina, em seguida, desinfectá-lo sob a luz UV por 2 horas em uma capa de cultura de tecidos. </li><li> As células HeLa placa na grade a uma densidade de ...

<ol>
	<li>Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cells+at+the+nanoscale.">Visualizing cells at the nanoscale.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).</li><li>Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+3D+intermediates+of+membrane+fusion+in+herpes+simplex+virus+1+entry.">Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).</li><li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+intracellular+behavior+of+HIV+in+living+cells.">Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells.</a> The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).</li><li>Arhel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+four-dimensional+tracking+of+cytoplasmic+and+nuclear+HIV-1+complexes.">Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes.</a> Nature Methods. 3, 817-824 (2006).</li><li>Gousset, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+HIV-1+GAG+trafficking+in+infected+macrophages.">Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages.</a> PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).</li><li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Koch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fusion+of+pseudotyped+HIV-1+particles+in+real+time+by+live+cell+microscopy.">Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy.</a> Retrovirology. 6, 84 (2009).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+chemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr.</a> Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).</li><li>Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+structure+determination+of+native+mammalian+cells+using+cryo-FIB+and+cryo-electron+tomography.">3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).</li><li>Sartori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography.">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).</li><li>Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+vitreous+sections+from+cultured+mammalian+cells.">Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells.</a> Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).</li><li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+HIV-1+with+correlative+live-cell+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography.</a> Structure. 19, 1573-1581 (2011).</li><li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors.">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).</li><li>Agronskaia, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy.">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li><li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy.">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li></ol>

Nós apresentamos um conjunto simples de protocolos para fornecer uma abordagem correlativa avançada para analisar eventos celulares dinâmicos usando time-lapse imagens de fluorescência confocal, em células vivas seguido por cryoET. Nosso desenvolvimento metodológico para correlacionar a imagem ao vivo de células em 3D com alta resolução cryoET é fundamental para investigar muitos problemas biológicos desafiadoras, tais como a visualização, dinâmico (não estático, como relatado anteriormente), e difraçã...

Tomografia crio-eletrônico (cryoET) é uma técnica de imagem poderosa que permite a visualização tridimensional (3D) de células e tecidos e fornece insights sobre a organização de organelas nativas e estruturas celulares com resolução molecular em um de perto o estado fisiológico 1. No entanto, a natureza inerentemente não corado de baixo contraste amostra congelada-hidratado, combinada com a sua sensibilidade à radiação, torna difícil localizar áreas de interesse dentro de uma célula e, subsequentemente, realizar a série de inclinação com êxito, sem danificar a zona alvo. A fim de superar estes problemas, uma abordagem que combina correlativo microscopia óptica e electrónica é necessária. Especificidades destacadas por meio de rotulagem fluorescente são identificados e localizado por microscopia de fluorescência de luz, e, em seguida, as suas coordenadas são transferidos para o microscópio electrónico de aquisição de dados estruturais de alta resolução em 3D. Este método correlativo ajuda para localizar o alvo de umreas de interesse a serem abordados. Devido à limitação da espessura da amostra com cryoEM (&lt;300 nm), actualmente apenas as regiões periféricas da célula são adequadas para análise estrutural por CryoET 3D. Reduzindo ainda mais a espessura das amostras congeladas hidratadas por vítreo secção 8 ou crio-concentrado feixe de íons (FIB) moagem 9 iria expandir a capacidade de imagem correlativa. Anteriormente, os métodos correlatos foram utilizados principalmente para facilitar a aquisição de dados cryoET para grandes e estática das estruturas 10-13. Nestes estudos, crio etapas foram implementadas para aceitar grades cryoEM e caber em cada um microscópio vertical ou um microscópio invertido 10,11,14. Embora a mudança grades parece bastante simples em seus projetos, há adicional de transferência etapas envolvidas para a grade de EM, aumentando a chance de que a grade pode ser deformada, danificada e contaminada. Recentemente, demonstrou um avanço técnico emmicroscopia correlativa que nos permite visualizar diretamente os eventos dinâmicos que são, por natureza, difícil de capturar, como o HIV-1 e as interações da célula hospedeira em estágios iniciais da infecção 15. Conseguimos isso através da concepção e implementação de um estágio da amostra crio-microscopia de luz que adapta um sistema de cartucho para minimizar os danos espécime devido ao manuseio da rede, facilitando assim a correlação. Nosso projeto inclui um suporte integrado cartucho espécime, permitindo que tanto crio-microscopia de luz e crio-eletrônico a ser realizado, em seqüência, no mesmo suporte da amostra, sem transferência de amostras, agilizando assim o processo correlato. Além disso, também implementado um procedimento de correlação exacta e fiável utilizando esferas de látex fluorescentes como marcadores fiduciais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine</td>
			<td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td>
			<td>12-604F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>HeLa cell culture on EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell tracker</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>Red CMTPX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A gold conjugates</td>
			<td>Ted Pella, Inc., Redding, CA</td>
			<td>15822-1</td>
			<td>15 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;m fluorescent microspheres</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>F8811</td>
			<td>Yellow-green fluorescent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal calf bovine serum</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>10082-139</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom culture dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold quantifoil finder EM grids</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany</td>
			<td>R2/2 Au NH2 200 mesh</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow-discharge device 100X</td>
			<td>EMS, Hatfield, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 microscope</td>
			<td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE microscope</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sweptfield confocal microscope</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokai Hit live cell chamber</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-fluorescence sample stage</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative microscopy for 3d structural analysis of dynamic interactions

Tomografia crio-eletrônico (cryoET) permite a visualização em 3D de estruturas celulares com resolução molecular em um estado próximo do fisiológico 1. No entanto, a visualização directa de complexos virais individuais no seu ambiente celular do hospedeiro com cryoET é um desafio 2, devido à natureza pouco frequentes e dinâmica de entrada viral, especialmente no caso do VIH-1. Enquanto lapso de tempo de imagem de células vivas produziu uma grande quantidade de informações sobre muitos aspectos do ciclo de HIV-janeiro 03-07 de vida, a resolução oferecida por microscopia de células vivas é limitado (~ 200 nm). Nosso trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um método de correlação que permite a visualização direta dos eventos iniciais da infecção pelo HIV-1 pela combinação de microscopia de luz fluorescente de células vivas, crio-microscopia fluorescente e cryoET. Deste modo, os sinais vivo de células e crio-fluorescente pode ser utilizada para orientar a amostragem de precisão cryoET. Além disso, a informação estrutural obtida a partir de cryoET pode be complementado com os dados funcionais dinâmicos adquirida através de imagens ao vivo de células de alvo marcado fluorescente. Neste artigo de vídeo, nós fornecemos métodos detalhados e protocolos para investigação estrutural do HIV-1 e interações célula hospedeira usando imagens ao vivo de células em 3D correlativo de alta velocidade e análise estrutural cryoET de alta resolução. As células HeLa infectadas com o HIV-1 partículas foram caracterizadas pela primeira vez por microscopia confocal em células vivas, e a região contendo a mesma partícula viral foi então analisado por tomografia crio-electrónica para detalhes estruturais 3D. A correlação entre dois conjuntos de dados de imagem, de imagem óptica e eletrônica de imagem, foi realizada através de microscopia de luz fase crio-fluorescência construídos em casa. A abordagem aqui pormenorizadas serão úteis não só para o estudo das interacções das células do vírus-hospedeiro, mas também para várias aplicações em biologia celular, tais como sinalização, o tráfico de receptor de membrana da célula, e em muitos outros processos celulares dinâmicas. &lt;/ P&gt;

Para caracterizar o comportamento dinâmico das partículas de vírus, as células HeLa infectadas com o HIV-1 foram visualizados por meio de microscopia confocal de células vivo de alta velocidade e os movimentos das partículas foram analisadas por rastreamento automatizado de partículas 3D (Figura 1). Para evitar que o lapso de tempo de vários minutos, que pode ocorrer entre a colheita da última imagem ao vivo de células confocal e de imersão de congelação (o que pode ser suficiente para perd...

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Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Nós descrevemos um método de microscopia correlativa que combina alta velocidade de microscopia de luz fluorescente de células vivas 3D de alta resolução tomografia crio-eletrônico. Nós demonstrar a capacidade do método dinâmico de imagem por correlativo, as pequenas partículas de HIV-1 que interagem com células HeLa hospedeiras.

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