Name: correlative microscopy for 3d structural analysis of dynamic interactions
Uploaded: 2013-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Трэвис Уилер и механической мастерской на кафедре клеточной биологии и физиологии Университета Питтсбурга для строительства крио-флуоресценции образца этапе Changlu Тао и Чэн Сюй в Университете науки и технологии Китая за техническую помощи, и д-р Тереза ​​Brosenitsch за критическое прочтение рукописи. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья (GM082251 &amp; GM085043).

1. Культура клеток HeLa на покрытые углеродом, золото EM Finder сети <ol><li> Тлеющего разряда углерода стороне 200 меш R2 / 2 Quantifoil золото EM искатель сетки при 25 мА в течение 25 сек. </li><li> Пальто с сеткой EM фибронектин, путем размещения его, углерода стороной вниз, на 40 мкл капли 50 мкг / мл раствора фибро?...

<ol>
	<li>Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cells+at+the+nanoscale.">Visualizing cells at the nanoscale.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).</li><li>Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+3D+intermediates+of+membrane+fusion+in+herpes+simplex+virus+1+entry.">Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).</li><li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+intracellular+behavior+of+HIV+in+living+cells.">Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells.</a> The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).</li><li>Arhel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+four-dimensional+tracking+of+cytoplasmic+and+nuclear+HIV-1+complexes.">Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes.</a> Nature Methods. 3, 817-824 (2006).</li><li>Gousset, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+HIV-1+GAG+trafficking+in+infected+macrophages.">Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages.</a> PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).</li><li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Koch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fusion+of+pseudotyped+HIV-1+particles+in+real+time+by+live+cell+microscopy.">Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy.</a> Retrovirology. 6, 84 (2009).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+chemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr.</a> Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).</li><li>Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+structure+determination+of+native+mammalian+cells+using+cryo-FIB+and+cryo-electron+tomography.">3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).</li><li>Sartori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography.">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).</li><li>Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+vitreous+sections+from+cultured+mammalian+cells.">Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells.</a> Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).</li><li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+HIV-1+with+correlative+live-cell+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography.</a> Structure. 19, 1573-1581 (2011).</li><li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors.">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).</li><li>Agronskaia, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy.">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li><li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy.">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li></ol>

Мы представили простой набор протоколов для обеспечения передовых корреляционный подход для анализа динамических событий с помощью сотовой покадровой конфокальной, живых клеток флуоресценции последующим cryoET. Наши методологических разработок соотнести 3D Live-ячейки изображения с выс...

Крио-электронной томографии (cryoET) является мощным методом визуализации, которая позволяет трехмерные (3D) визуализации клеток и тканей и дает представление о родной организации органеллы и клеточные структуры на молекулярном разрешение в близких к физиологическим состоянием 1. Тем не менее, по существу низкий контраст неокрашенных замороженных гидратированный образец, в сочетании с их чувствительность к облучению, делает его трудно обнаружить области, представляющие интерес внутри клетки, а затем выполнения наклона серии успешно без повреждения целевой области. Для того чтобы преодолеть эти проблемы, корреляционный подход, который сочетает в себе световой и электронной микроскопии необходимо. Особенности подчеркивается флуоресцентное мечение определены и находятся с помощью флуоресцентной световой микроскопии, а затем их координаты передаются в электронном микроскопе на приобретение высоким разрешением 3D структурных данных. Это корреляционный метод помогает размещения целевыхREAS интереса решать. Из-за ограничений на толщину образца с cryoEM (&lt;300 нм), в настоящее время только периферийных областей клетки подходят для 3D структурного анализа CryoET. Дальнейшее уменьшение толщины замороженных гидратированных образцов стекловидного секционирования по 8 или по крио-сфокусированного ионного пучка (FIB) 9 фрезерных бы расширить возможности корреляционного изображений. Ранее корреляционного методов использовались в первую очередь для облегчения cryoET сбора данных для крупных и статические структуры 10-13. В этих исследованиях, крио-туров были реализованы принять cryoEM сетей и помещается на любом прямой микроскоп или инвертированный микроскоп 10,11,14. Хотя переключение сетей кажется довольно простым в своих проектах, существуют дополнительные этапы передачи для сетки EM, увеличивая вероятность того, что сетка может быть деформирована, поврежденные и загрязненные. Мы недавно продемонстрировал технический прогресс вкорреляционной микроскопии, которая позволяет нам непосредственно визуализировать динамические события, которые по своей природе трудно уловить, таких как ВИЧ-1 и взаимодействия клетка-хозяин на ранних стадиях инфекции 15. Мы добились этого путем разработки и осуществления Cryo-световой микроскопии предметный столик, который адаптирует системы картриджа, чтобы минимизировать повреждение образца из-за сетки обработки, что облегчает корреляцию. Наш дизайн включает в себя интегрированный держатель картриджа образца, что позволяет как крио-свет и крио-электронной микроскопии должны быть выполнены последовательно, на том же держателе образца, без переноса образца, что позволило бы упростить корреляционного процесса. Кроме того, мы также внедрили точной и надежной корреляции процедуры с использованием флуоресцентных латексных как координатных меток.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine</td>
			<td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td>
			<td>12-604F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>HeLa cell culture on EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell tracker</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>Red CMTPX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A gold conjugates</td>
			<td>Ted Pella, Inc., Redding, CA</td>
			<td>15822-1</td>
			<td>15 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;m fluorescent microspheres</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>F8811</td>
			<td>Yellow-green fluorescent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal calf bovine serum</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>10082-139</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom culture dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold quantifoil finder EM grids</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany</td>
			<td>R2/2 Au NH2 200 mesh</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow-discharge device 100X</td>
			<td>EMS, Hatfield, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 microscope</td>
			<td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE microscope</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sweptfield confocal microscope</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokai Hit live cell chamber</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-fluorescence sample stage</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative microscopy for 3d structural analysis of dynamic interactions

Крио-электронной томографии (cryoET) позволяет 3D-визуализации клеточных структур на молекулярном разрешение в близких к физиологическим состоянием 1. Тем не менее, прямой визуализации отдельных вирусных комплексов в их среде клетки-хозяина с cryoET 2 является сложной задачей, в связи с нечастыми и динамичный характер проникновении вируса в клетку, особенно в случае ВИЧ-1. В то время как покадровой живых клеток изображений дало большое количество информации о многих аспектах жизненного цикла ВИЧ-1, 3-7, разрешение предоставляемой живых клеток микроскопии ограничена (~ 200 нм). Наша работа была направлена ​​на разработку корреляционный метод, который позволяет прямой визуализации ранние события инфекции ВИЧ-1 путем объединения живых клеток флуоресцентной микроскопии свет, крио-флуоресцентной микроскопии и cryoET. Таким образом, живых клеток и крио-флуоресцентные сигналы могут быть использованы для точного направления выборки в cryoET. Кроме того, структурная информация, полученная из cryoET можно бэлектронной дополнена динамической функциональной данных, полученных через живые клеток изображений флуоресцентных помечены цели. В этом видео статье мы подробно методы и протоколы для структурных исследований ВИЧ-1 и клетки-хозяина взаимодействий с использованием 3D корреляционного высокоскоростной живых клеток изображений с высоким разрешением cryoET структурного анализа. HeLa клетки, инфицированные ВИЧ-1 Частицы характеризуют первую помощью конфокальной живых клеток микроскопии и область, содержащую те же вирусные частицы затем анализировали на крио-электронной томографии для 3D структурные детали. Корреляции между двумя наборами данных изображений, оптических изображений и электронных изображений, была достигнута с помощью самодельного крио-флуоресценции световой микроскопии этапе. Подход здесь подробно будет ценен не только для изучения вирус-хозяин взаимодействий клетки, но и для более широкого применения в клеточной биологии, таких как сотовые сигнализации, торговлей мембранным рецептором, и много других динамических клеточных процессов. &lt;/ P&gt;

Чтобы охарактеризовать динамическое поведение вирусные частицы, HeLa, клетки, инфицированные ВИЧ-1, были обследованы на высокоскоростных конфокальной живых клеток микроскопии и движения частиц были проанализированы автоматизированных 3D отслеживания частицы (Рис. 1). Чтобы изб?...

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions at JoVE.com

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Мы описываем корреляционный метод микроскопии, что сочетает в себе высокую скорость 3D живых клеток свете флуоресцентной микроскопии высокого разрешения и крио-электронной томографии. Показана возможность корреляционного метода динамического изображения, небольшие ВИЧ-1 частиц, взаимодействующих с клетками-хозяевами HeLa.

Корреляционно микроскопии для 3D Структурный анализ динамических взаимодействий

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Изучение стехиометрии рецептор эпидермального фактора роста в интактных клетках, используя КОРРЕЛЯЦИОННЫМ микроскопия

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Подготовка 3D Коллаген Гели и микроканалов для изучения 3D взаимодействий<em&gt; В Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Коррелятивное свето- и электронной микроскопии с помощью Quantum Dot Наночастицы

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Моделирование рака яичников Многоклеточная Сфероид Поведение в микроустройство Dynamic 3D перитонеального

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Высокая пропускная способность сотовых микрочипов платформы для корреляционного анализа клеточной дифференциации и тяговых усилий

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Корреляционные света электронной микроскопии (Клем) для отслеживания и обработки изображений вирусного белка связанные структуры в клетках, крио прикол

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Строительство многослойных мезенхимальных стволовых клеток листа с системой 3D динамичной культуры

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

Экологические динамический механический анализ предсказать размягчения поведение нейронные имплантаты

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

3D анализ Мультиклеточных реакций на Хемоаттрактантные градиенты

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Four-Dimensional CT Analysis Using Sequential 3D-3D Registration

Четырехмерный Анализ КТ с использованием последовательной 3D-3D Регистрации

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data ...