Name: isolation, processing and analysis of murine gingival cells
Uploaded: 2013-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af tilskud fra Israel Science Foundation (nr. 1418-1411) til AHH og (nr. 1933-1912) til AW, den tyske israelske Foundation for unge efterforskere (GIF Young) til AHH og Dr. I . Cabakoff Research Endowment Fund på Hebrew University-Hadassah School of Dental Medicine til AHH og AW.

Forbered på forhånd: <ul><li> PBS + 2% FCS </li><li> PBS + 2% FCS med 2 mg / ml collagenase type II og 1 mg / ml DNAse type I (1 ml per prøve) </li><li> Steriliserede kirurgiske instrumenter </li><li> 0,5 M EDTA-opløsning </li></ul> 1.. Upper Gingival Excision Technique <ol><li> Afliv mus bruger godkendte IACUC vejledning. </li><li> Skær begge sider af mundhulen, herunder kinder og underkæben ramus med en skarp / sløv lige saks. </li><li> Træk ned underkæben. </li><li> Skær de bl?...

<ol>
	<li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cells+down-regulate+inflammation-driven+alveolar+bone+loss.">Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).</li><li>Listgarten, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+periodontitis.">Pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).</li><li>Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causation+and+pathogenesis+of+periodontal+disease.">Causation and pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontol. 25, 8-20 (2000).</li><li>Jotwani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+dendritic+cells+infiltrate+the+T+cell-rich+region+of+oral+mucosa+in+chronic+periodontitis:+in+situ,+in+vivo,+and+in+vitro+studies.">Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies.</a> J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).</li><li>Graves, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+antagonists+inhibit+the+progression+of+inflammatory+cell+infiltration+toward+alveolar+bone+in+experimental+periodontitis.">Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis.</a> J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).</li><li>Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+chemokine+(MCP-1,+MIP-1alpha,+MIP-1beta,+IP-10,+RANTES)-positive+cells+and+chemokine+receptor+(CCR5,+CXCR3)-positive+cells+in+inflamed+human+gingival+tissues.">The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues.</a> Cytokine. 20, 70-77 (2002).</li><li>Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cell+dynamics+in+human+gingiva+during+experimentally+induced+inflammation.">Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation.</a> J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).</li><li>Cochran, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+bone+loss+in+periodontal+disease.">Inflammation and bone loss in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).</li><li>Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response:+the+key+to+bone+resorption+in+periodontal+disease.">Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).</li><li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis.">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).</li></ol>

Maxilla gingivale væv fra en enkelt mus er tilstrækkelige til at analysere sub-populationer af T-og B-lymfocytter, samt deres evne til at udtrykke ekstracellulære og intracellulære molekyler, som vi tidligere beskrevet 1.. Men hvis sjældne cellepopulationer er af interesse (f.eks DCS), anbefales det at samle væv 2-3 mus. Det skal bemærkes, hvis foretrækkes, er det muligt at skrælle både palatinalt og gingival væv og derefter til udskæring af tandkødet (en ændring af trin 1,8-1,9). Det bør også...

Gingiva er det bløde væv omkring den cervikale del af tænderne og dækker den alveolære proces (figur 1). Tandkødet er en type af tyggemæssig slimhinde, som kan adskilles yderligere i slimhindeepitelet og bindevæv (også kendt som submucosa eller lamina propria). Den anatomiske struktur gingiva og tilstødende tænder tillader bakterier at opholde sig og udvikle plak (biofilm), som konstant udfordrer det lokale immunforsvar. Som et resultat, udvikler inflammatorisk respons i tandkødet, som under visse omstændigheder bliver ødelæggende - en tilstand kaldet parodontale sygdomme 2. Grundlæggende kan plak-inducerede periodontale patologier opdeles i tandkødsbetændelse og parodontose. Gingivitis er en reversibel tilstand af lokal inflammatorisk respons, der er begrænset til gingiva. Parodontitis, på den anden side, er en irreversibel destruktiv proces, hvor fastgørelsen apparat (alveoleknoglen, periodontalledbånd, cementum og gingiva), destrueres 3.. Gingiva blev foreslået at tjene både som effektor og induktive sites under parodontose 4.. Humane undersøgelser har antydet, at som svar på plak, immuneffektorceller og molekyler dynamisk infiltreret eller afgang gingiva 5-7. Denne aktivitet blev vist at spille en vigtig rolle i parodontal destruktion 8,9. Betragtninger data genereret af disse undersøgelser, værdifulde oplysninger om denne patologiske proces, der arbejder med humant væv besidder store etiske, tekniske og eksperimenterende begrænsninger. Udviklingen af eksperimentelle modeller tilladt årsag-virknings-eksperimenter via ansætte transgene mus og in vivo interventioner 10. Som følge heraf steg vores viden om de mekanismer, der er involveret i paradentose betydeligt i de seneste to årtier. Selv så, på grund af kompleksiteten af ​​parodontale sygdomme, der eren løbende debat om arten af ​​lokale immunrespons letter vævsødelæggelser. Der er også en mangel i vores forståelse af funktionen af ​​centrale immunceller i gingiva under periodontale sygdomme. Det er derfor vigtigt at undersøge patologiske inflammatoriske begivenheder i målvævet af sygdommen, gingiva.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Comments (optional)</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Company</td>
 <td>Name of the reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>CLS-2</td>
 <td>Worthington Biochemical Corp.</td>
 <td>Collagenase Type II</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>DN25-1G</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>DNAse I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>E6758-100G</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>EDTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>D8537</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat Inactivated</td>
 <td>04-121-1</td>
 <td>Biological Industries</td>
 <td>Fetal Bovine Serum </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>FPE-204-500</td>
 <td>Jet Biofil</td>
 <td>Vacuum-Driven Filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>352052</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>93070</td>
 <td>SPL Lifesciences</td>
 <td>Cell Strainer 70 &mu;m</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>153066</td>
 <td>NUNC</td>
 <td>Tissue Culture Dish 35&times;10 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>554714</td>
 <td>BD</td>
 <td>BD Cytofix/Cytoperm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone N418</td>
 <td>117305</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD11c antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 104</td>
 <td>109819</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD45.2 antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone GK1.5</td>
 <td>100413</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD4 antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 53-6.7</td>
 <td>100733</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD8a antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 17A2</td>
 <td>100214</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD3 antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone G8.8</td>
 <td>118219</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 929F3.01</td>
 <td>DDX0362D</td>
 <td>Imgenex</td>
 <td>Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 39-10-8</td>
 <td>115010</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>LSR II Flow Cytometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Tree Star</td>
 <td>FlowJo Software v 7.6.5</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation, processing and analysis of murine gingival cells

Vi har udviklet en teknik til præcist isolere og behandle murin tandkødsvæv til flowcytometri og molekylære studier. Tandkødet er en unik og vigtig væv at studere immunmekanismer fordi det er involveret i vært immunrespons mod oral biofilm, kan forårsage periodontale sygdomme. Endvidere muliggør den tætte nærhed af gingiva til alveoleknoglen væv også studere knogleremodelleringen under betændelsestilstande. Vores metode giver store mængder af immunceller, der tillader analyse af selv sjældne cellepopulationer, såsom Langerhanske celler og T regulatoriske celler, som vi tidligere vist 1.. Anvender mus at studere lokale immunresponser involveret i alveoleknogletab under parodontose er fordelagtig på grund af tilgængeligheden af ​​forskellige immunologiske og eksperimentelle værktøjer. Alligevel, på grund af deres lille størrelse og relativt ubekvemme adgang til det murine gingiva mange undersøgelser undgås undersøgelse af This kritisk væv. Metoden i dette arbejde kan gøre det lettere gingival analyse som forhåbentlig vil øge vores underdrive den mundtlige immunsystemet og dets rolle under parodontose.

Eksempler på flowcytometri analyse på gingivale celler præsenteres. Gingivale celler poolet fra 2 mus blev kørt i en LSR II flowcytometer og analyseres ved hjælp FlowJo software. Figur 3A viste fordelingen af gingivale celler fra naive mus i en side scatter (SSC) versus frontal scatter (FSC) plot. Gating strategi til at identificere (i) lymfocytter (ii) monocytter / dendritiske celler og (iii) granulocytter er indiceret. Til sammenligning formål, også præsenterer vi en FACS plot illustrerer ging...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells at JoVE.com

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Denne undersøgelse beskriver en effektiv teknik til at isolere og behandle gingivale væv fra muse mundhulen for at producere en enkelt cellekultur. De resulterende celler kan yderligere anvendes til flowcytometrianalyse og molekylære studier.

Isolation, behandling og analyse af murine Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifikation og oprensning af murine thymusepitelmonolag Celler

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolering af murine lymfeknuder stromacellers

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Isolering af murine peritoneale makrofager til Carry Out genekspressionsanalyse Upon Toll-lignende receptorer Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolering og flowcytometrisk analyse af immunceller fra iskæmisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering og flowcytometrianalyse gliom-infiltrerende perifere mononukleære blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Isolation, karakterisering og funktionelle Undersøgelse af Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Isolering og aktivering af murine lymfocytter

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolering og flowcytometrisk analyse for Human endocervikale Gamma Delta T-celler

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Fordøjelsen af Murine leveren en Flow Cytometric analyse af lymfatisk Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...