Name: isolation, processing and analysis of murine gingival cells
Uploaded: 2013-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells at JoVE.com

Cette recherche a été financée par des subventions de la Fondation Israël sciences (n ° 1418-1411) à AHH et (n ° 1933-1912) à AW, la Fondation israélienne allemand pour les jeunes chercheurs (GIF Young) à AHH, et le Dr. I . Fonds Cabakoff recherche dotation à l&#39;École de médecine dentaire à AHH et AW Hebrew University-Hadassah.

Préparez à l&#39;avance: <ul><li> PBS + 2% SVF </li><li> PBS + 2% SVF à 2 mg / ml de collagénase de type II et 1 mg / ml de DNAse type I (1 ml par échantillon) </li><li> Instruments chirurgicaux stérilisés </li><li> Une solution d&#39;EDTA 0,5 M. </li></ul> 1. Upper Technique Excision gingivale <ol><li> Euthanasier les souris utilisant un guidage IACUC approuvé. </li><li> Couper les deux côtés de la cavité buccale, y compris les joues et la branche mandibule avec une nette / mous...

<ol>
	<li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cells+down-regulate+inflammation-driven+alveolar+bone+loss.">Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).</li><li>Listgarten, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+periodontitis.">Pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).</li><li>Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causation+and+pathogenesis+of+periodontal+disease.">Causation and pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontol. 25, 8-20 (2000).</li><li>Jotwani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+dendritic+cells+infiltrate+the+T+cell-rich+region+of+oral+mucosa+in+chronic+periodontitis:+in+situ,+in+vivo,+and+in+vitro+studies.">Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies.</a> J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).</li><li>Graves, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+antagonists+inhibit+the+progression+of+inflammatory+cell+infiltration+toward+alveolar+bone+in+experimental+periodontitis.">Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis.</a> J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).</li><li>Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+chemokine+(MCP-1,+MIP-1alpha,+MIP-1beta,+IP-10,+RANTES)-positive+cells+and+chemokine+receptor+(CCR5,+CXCR3)-positive+cells+in+inflamed+human+gingival+tissues.">The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues.</a> Cytokine. 20, 70-77 (2002).</li><li>Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cell+dynamics+in+human+gingiva+during+experimentally+induced+inflammation.">Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation.</a> J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).</li><li>Cochran, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+bone+loss+in+periodontal+disease.">Inflammation and bone loss in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).</li><li>Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response:+the+key+to+bone+resorption+in+periodontal+disease.">Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).</li><li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis.">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).</li></ol>

Maxillaire tissus gingivaux obtenus à partir d&#39;un simple clic de souris suffisent pour analyser les sous-populations de lymphocytes T et B, ainsi que leur capacité à exprimer des molécules extracellulaires et intracellulaires comme nous l&#39;avons décrit précédemment 1. Néanmoins, si les populations de cellules rares sont d&#39;un intérêt (par exemple PED), il est recommandé pour les tissus de la piscine 2-3 souris. Fait à noter, si préférable, il est possible de peler les deux tissus palat...

Gencive est le tissu mou qui entoure la partie du col de la dent, et couvre le processus alvéolaire (figure 1). La gencive est un type de muqueuse masticatoire qui peuvent être divisées en épithélium de la muqueuse et des tissus conjonctifs (aussi connu comme sous-muqueuse ou de la lamina propria). La structure anatomique de la gencive et des dents adjacentes permet aux bactéries de résider et de développer la plaque (biofilm) qui défie constamment le système immunitaire local. En conséquence, la réponse inflammatoire se développe dans la gencive, qui dans certaines circonstances devient destructive - un état ​​appelé maladies parodontales 2. Fondamentalement, les pathologies parodontales plaque induits peuvent être divisés en gingivite et la parodontite. La gingivite représente un état réversible de la réponse inflammatoire locale qui se limite à la gencive. La parodontite, d&#39;autre part, est un processus de destruction irréversible dans lequel le dispositif de fixation (os alvéolaire, parodontaleligament, cément et la gencive) est détruit 3. La gencive a été proposé pour servir à la fois comme des sites effecteurs et inductive pendant les maladies parodontales 4. Les études humaines ont suggéré que, en réponse à la plaque dentaire, des cellules et des molécules effectrices de l&#39;immunité infiltrés ou au départ de la gencive 5-7 dynamiquement. Cette activité a été montré à jouer un rôle majeur dans la destruction parodontale 8,9. Alors que les données générées par ces études ont fourni des informations précieuses sur ce processus pathologique, en collaboration avec les tissus humains possèdent principales limites éthiques, techniques et expérimentaux. Le développement de modèles expérimentaux ont permis expérimentations de cause à effet via employant des souris transgéniques et des interventions in vivo 10. En conséquence, nos connaissances sur les mécanismes impliqués dans la maladie parodontale a considérablement augmenté au cours des deux dernières décennies. Même si, en raison de la complexité des maladies parodontales, il estun débat sur la nature de la réponse immunitaire locale faciliter la destruction des tissus. Il ya aussi un manque dans notre compréhension de la fonction des cellules immunitaires centrales dans la gencive au cours de maladies parodontales. Il est donc essentiel d&#39;étudier les événements inflammatoires pathologiques qui se produisent dans le tissu cible de la maladie, de la gencive.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Comments (optional)</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Company</td>
 <td>Name of the reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>CLS-2</td>
 <td>Worthington Biochemical Corp.</td>
 <td>Collagenase Type II</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>DN25-1G</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>DNAse I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>E6758-100G</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>EDTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>D8537</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat Inactivated</td>
 <td>04-121-1</td>
 <td>Biological Industries</td>
 <td>Fetal Bovine Serum </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>FPE-204-500</td>
 <td>Jet Biofil</td>
 <td>Vacuum-Driven Filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>352052</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>93070</td>
 <td>SPL Lifesciences</td>
 <td>Cell Strainer 70 &mu;m</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>153066</td>
 <td>NUNC</td>
 <td>Tissue Culture Dish 35&times;10 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>554714</td>
 <td>BD</td>
 <td>BD Cytofix/Cytoperm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone N418</td>
 <td>117305</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD11c antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 104</td>
 <td>109819</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD45.2 antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone GK1.5</td>
 <td>100413</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD4 antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 53-6.7</td>
 <td>100733</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD8a antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 17A2</td>
 <td>100214</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD3 antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone G8.8</td>
 <td>118219</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 929F3.01</td>
 <td>DDX0362D</td>
 <td>Imgenex</td>
 <td>Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 39-10-8</td>
 <td>115010</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>LSR II Flow Cytometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Tree Star</td>
 <td>FlowJo Software v 7.6.5</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation, processing and analysis of murine gingival cells

Nous avons développé une technique pour isoler et traiter le tissu gingival murin pour la cytométrie en flux et des études moléculaires précisément. La gencive est un tissu unique et important d&#39;étudier les mécanismes immunitaires, car il est impliqué dans la réponse immunitaire de l&#39;hôte contre le biofilm oral qui pourrait provoquer des maladies parodontales. En outre, la proximité de la gencive au tissu osseux alvéolaire permet également l&#39;étude du remodelage osseux dans des conditions inflammatoires. Notre méthode donne grande quantité de cellules immunitaires qui permet d&#39;analyser même les populations de cellules rares telles que les cellules de Langerhans et des cellules T régulatrices comme nous l&#39;avons démontré précédemment 1. Souris emploient pour étudier les réponses immunitaires locales impliquées dans la perte osseuse alvéolaire au cours des maladies parodontales est avantageux en raison de la disponibilité de divers outils immunologiques et expérimentale. Néanmoins, en raison de leur petite taille et l&#39;accès relativement gênant pour la gencive murin, de nombreuses études éviter examen de this tissus critique. La méthode décrite dans ce travail pourrait faciliter l&#39;analyse gingival, qui nous l&#39;espérons augmenter notre sous-estimer sur le système immunitaire par voie orale et son rôle au cours de maladies parodontales.

Exemples d&#39;analyse de cytométrie en flux sur des cellules gingivales sont présentés. Cellules gingivales groupées de 2 souris ont été exécutés dans un cytomètre de flux LSR II et analysées avec le logiciel FlowJo. Figure 3A démontré la distribution des cellules gingivales de souris naïves dans une diffusion latérale (SSC) par rapport dispersion vers l&#39;avant (FSC) intrigue. stratégie d&#39;ouverture de porte à identifier (i) les lymphocytes (ii) les monocytes / cellules dendritiqu...

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Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Cette étude décrit une technique efficace pour isoler et traiter des tissus gingivaux de la cavité buccale de la souris afin de produire une culture unicellulaire. Les cellules obtenues peuvent en outre être utilisés pour l&#39;analyse par cytométrie en flux et des études moléculaires.

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We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

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