Name: isolation, processing and analysis of murine gingival cells
Uploaded: 2013-07-02T14:00:00
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この研究は、イスラエル科学財団（番号1418から1411）からAHHと（番号1933から1912年）にAW、AHHに若い研究者のためのドイツのイスラエル財団（GIFヤング）、博士と私への補助金によって支えられてAHHとAWへの歯科医学のヘブライ大学 - ハダサスクールで。Cabakoff研究基金基金。

事前に準備します。 <ul><li> PBS + 2％FCS </li><li>コラゲナーゼタイプIIおよびDNアーゼタイプIの1 mg / mlの（サンプル当たり1ミリリットル）の2 mg / mlのとPBS + 2％FCS </li><li>滅菌手術器具</li><li> 0.5 M EDTA溶液</li></ul> 1。アッパー歯肉切除テクニック<ol><li>承認された動物実験委員会のガイダンスを使用して、マウスを安楽死させる。 </li><li>頬と鈍い/鋭いストレートハサミで下顎?...

<ol>
	<li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cells+down-regulate+inflammation-driven+alveolar+bone+loss.">Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).</li><li>Listgarten, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+periodontitis.">Pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).</li><li>Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causation+and+pathogenesis+of+periodontal+disease.">Causation and pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontol. 25, 8-20 (2000).</li><li>Jotwani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+dendritic+cells+infiltrate+the+T+cell-rich+region+of+oral+mucosa+in+chronic+periodontitis:+in+situ,+in+vivo,+and+in+vitro+studies.">Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies.</a> J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).</li><li>Graves, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+antagonists+inhibit+the+progression+of+inflammatory+cell+infiltration+toward+alveolar+bone+in+experimental+periodontitis.">Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis.</a> J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).</li><li>Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+chemokine+(MCP-1,+MIP-1alpha,+MIP-1beta,+IP-10,+RANTES)-positive+cells+and+chemokine+receptor+(CCR5,+CXCR3)-positive+cells+in+inflamed+human+gingival+tissues.">The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues.</a> Cytokine. 20, 70-77 (2002).</li><li>Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cell+dynamics+in+human+gingiva+during+experimentally+induced+inflammation.">Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation.</a> J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).</li><li>Cochran, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+bone+loss+in+periodontal+disease.">Inflammation and bone loss in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).</li><li>Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response:+the+key+to+bone+resorption+in+periodontal+disease.">Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).</li><li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis.">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).</li></ol>

単一のマウスから得られた上顎歯肉組織は、我々は以前に説明したように1外および細胞内の分子を発現するTリンパ球およびBリンパ球の亜集団、ならびにそれらの能力を分析するために十分である。希少細胞集団が興味（例えばDCの）である場合にもかかわらず、それは2-3マウスからプール組織に推奨されます。望ましい場合に注目すべきは、それが歯肉（ステップ1.8から1.9の変更）...

歯肉は、歯頸部の周囲の軟部組織である歯槽プロセス（ 図1）をカバーしています。歯肉はさらに、粘膜上皮と結合組織（また、粘膜または粘膜固有層とも呼ばれる）に分けることができる咀嚼粘膜の一種である。歯肉と隣接する歯の解剖学的構造は、細菌が常にローカル免疫系に挑戦プラーク（バイオフィルム）が存在し、開発することができます。結果として、炎症反応は、特定の状況では破壊的になる歯肉に発症-条件は、歯周病2と呼ば。基本的には、歯垢誘発性歯周病態は、歯肉炎と歯周炎に分けることができます。歯肉炎は歯肉に限定されている地元の炎症反応の可逆的な状態を表しています。歯周炎、その一方で、不可逆的な破壊的なプロセスである取付装置（歯槽骨、歯周靭帯、セメント質と歯肉）は3を破壊している。 歯肉は歯周病4時などのエフェクターや誘導サイトの両方を提供することを提案した。ヒトでの研究は、歯垢に対応して、免疫エフェクター細胞および分子が動的に浸潤または出発歯肉5-7を示唆している。この活性は、歯周破壊8,9において主要な役割を果たすことが示された。ヒト組織と協力し、この病理学的過程に関する貴重な情報を提供し、それらの研究によって生成されたデータは、主要な、倫理的、技術的、実験的な限界を持っているのに対し。トランスジェニックマウスを用いてビアおよびin vivoでの介入10因果実験法を許可した実験モデルの開発。その結果、歯周病に関与するメカニズムに関する我々の知識は、最後の二十年の間に大幅に増加した。そうであっても、歯周病の複雑さに起因がある組織破壊を促進する局所免疫応答の性質に関する進行中の議論。歯周病の間の歯肉の中心的な免疫細胞の機能に関する我々の理解に不足があります。それは病気、歯肉の標的組織で発生する病理学的炎症事象を研究することが不可欠です。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Comments (optional)</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Company</td>
 <td>Name of the reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>CLS-2</td>
 <td>Worthington Biochemical Corp.</td>
 <td>Collagenase Type II</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>DN25-1G</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>DNAse I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>E6758-100G</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>EDTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>D8537</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat Inactivated</td>
 <td>04-121-1</td>
 <td>Biological Industries</td>
 <td>Fetal Bovine Serum </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>FPE-204-500</td>
 <td>Jet Biofil</td>
 <td>Vacuum-Driven Filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>352052</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>93070</td>
 <td>SPL Lifesciences</td>
 <td>Cell Strainer 70 &mu;m</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>153066</td>
 <td>NUNC</td>
 <td>Tissue Culture Dish 35&times;10 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>554714</td>
 <td>BD</td>
 <td>BD Cytofix/Cytoperm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone N418</td>
 <td>117305</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD11c antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 104</td>
 <td>109819</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD45.2 antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone GK1.5</td>
 <td>100413</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD4 antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 53-6.7</td>
 <td>100733</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD8a antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 17A2</td>
 <td>100214</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD3 antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone G8.8</td>
 <td>118219</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 929F3.01</td>
 <td>DDX0362D</td>
 <td>Imgenex</td>
 <td>Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 39-10-8</td>
 <td>115010</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>LSR II Flow Cytometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Tree Star</td>
 <td>FlowJo Software v 7.6.5</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation, processing and analysis of murine gingival cells

我々は正確にフローサイトメトリーや分子の研究のためにネズミ歯肉組織を分離して処理するための技術を開発した。歯肉は、それが歯周病の原因となることがあり、口腔バイオフィルムに対する宿主免疫応答に関与しているため、免疫機構を研究するためのユニークで重要な組織である。さらに、歯槽骨組織への歯肉のすぐ近くには、炎症性の条件下で骨リモデリングを勉強できます。本手法は、我々は以前に1を示したようなランゲルハンス細胞およびT調節細胞でさえ希少細胞集団の分析を可能にする免疫細胞を大量に得られる。歯周病の間に歯槽骨の損失に関わる局所免疫応答を研究するためにマウスを採用するため、様々な免疫学的および実験的なツールの利用可能性に有利である。それにもかかわらず、彼らの小さなサイズとネズミ歯肉に比較的不便なアクセスによる、多くの研究は、THIの検査を避けたの重要な組織。この作品に記載された方法がうまくいけば、歯周病の間に私達の経口免疫システムに過小とその役割が大きくなり歯肉分析を容易にすることができます。

歯肉細胞に対するフローサイトメトリー分析の例が示されている。 2匹のマウスからのプールされた歯肉細胞をLSR IIフローサイトメーターで実行され、FlowJoソフトウェアを用いて分析した。 図3A側方散乱（SSC）対前方散乱（FSC）プロットにおけるナイーブマウスから歯肉細胞の分布を示した。識別するためのゲーティング戦略は、（i）リンパ球（ii）の単球/樹状細胞および（iii?...

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Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

この研究は、単一細胞培養を生成するために、マウス口腔から歯肉組織を分離して処理するための効率的な手法が記載されている。得られた細胞をさらにフローサイトメトリー分析および分子生物学的研究のために使用することができる。

マウス歯肉細胞の単離、処理と解析

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

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