Name: isolation, processing and analysis of murine gingival cells
Uploaded: 2013-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells at JoVE.com

Denna forskning har finansierats med bidrag från Israel Science Foundation (nr 1418-1411) till AHH och (nr 1933-1912) till AW, den tyska israeliska stiftelsen för unga forskare (GIF Young) till AHH, och Dr I . Cabakoff Research Donationsfond vid Hebrew University-Hadassah School of Dental Medicine till AHH och AW.

Förbered i förväg: <ul><li> PBS + 2% FCS </li><li> PBS + 2% FCS med 2 mg / ml kollagenas typ II och 1 mg / ml DNAse typ I (1 ml per prov) </li><li> Steriliserade kirurgiska instrument </li><li> 0,5 M EDTA-lösning </li></ul> Ett. Övre Gingival excision Technique <ol><li> Euthanize möss med godkända IACUC vägledning. </li><li> Skär båda sidorna av munhålan inklusive kinderna och underkäken ramusen med en vass / trubbig raka sax. </li><li> Dra ned underkäken. </li><li> Skär de mj...

<ol>
	<li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cells+down-regulate+inflammation-driven+alveolar+bone+loss.">Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).</li><li>Listgarten, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+periodontitis.">Pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).</li><li>Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causation+and+pathogenesis+of+periodontal+disease.">Causation and pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontol. 25, 8-20 (2000).</li><li>Jotwani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+dendritic+cells+infiltrate+the+T+cell-rich+region+of+oral+mucosa+in+chronic+periodontitis:+in+situ,+in+vivo,+and+in+vitro+studies.">Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies.</a> J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).</li><li>Graves, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+antagonists+inhibit+the+progression+of+inflammatory+cell+infiltration+toward+alveolar+bone+in+experimental+periodontitis.">Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis.</a> J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).</li><li>Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+chemokine+(MCP-1,+MIP-1alpha,+MIP-1beta,+IP-10,+RANTES)-positive+cells+and+chemokine+receptor+(CCR5,+CXCR3)-positive+cells+in+inflamed+human+gingival+tissues.">The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues.</a> Cytokine. 20, 70-77 (2002).</li><li>Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cell+dynamics+in+human+gingiva+during+experimentally+induced+inflammation.">Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation.</a> J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).</li><li>Cochran, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+bone+loss+in+periodontal+disease.">Inflammation and bone loss in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).</li><li>Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response:+the+key+to+bone+resorption+in+periodontal+disease.">Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).</li><li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis.">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).</li></ol>

Överkäke gingival vävnaderna från en enda mus är tillräckliga för att analysera undergrupper av T-och B-lymfocyter, liksom deras förmåga att uttrycka extracellulära och intracellulära molekyler som vi tidigare beskrivits 1. Men om sällsynta cellpopulationer är av intresse (t.ex. DC), rekommenderas att slå vävnader 2-3 möss. Notera, om föredraget, är det möjligt att skala både palatala och gingival vävnad och sedan till punktskattepliktiga tandköttet (en modifiering av steg 1,8-1,9). Det ...

Gingiva är den mjuka vävnaden som omger cervikala delen av tänderna och täcker den alveolära processen (figur 1). Tandköttet är en typ av tugg slemhinna som kan separeras ytterligare i mukosal epitel och bindväv (även känd som submukosa eller lamina propria). Den anatomiska strukturen av tandköttet och angränsande tänder gör att bakterier att bosätta sig och utveckla plack (biofilm) som ständigt utmanar det lokala immunförsvaret. Som ett resultat utvecklar inflammatoriska reaktionen i gingiva, vilket under vissa omständigheter blir destruktiv - ett tillstånd som kallas parodontala sjukdomar 2. I grund och botten, kan plack-inducerade parodontala sjukdomar delas in gingivit och parodontit. Gingivit representerar en reversibel tillstånd av lokala inflammatoriska responsen som är begränsad till gingiva. Periodontit, å andra sidan, är en irreversibel destruktiv process där fästanordningen (alveolärt ben, periodontalligament, cementum och tandkött) är förstörd 3. Gingiva föreslogs att tjäna både som effektorceller och induktiva platser under parodontala sjukdomar 4. Mänskliga studier har föreslagit att som svar på dental plack, immuneffektorceller och molekyler dynamiskt infiltreras eller avgång tandköttet 5-7. Denna aktivitet visat sig spela en viktig roll i parodontal destruktion 8,9. De data som genereras av dessa studier som värdefull information om denna patologiska process, som arbetar med mänskliga vävnader besitter stora etiska, tekniska och experimentella begränsningar. Utvecklingen av experimentella modeller tillåtna orsak-verkan experimenterande via anställa transgena möss och in vivo interventioner 10. Som ett resultat, ökat vår kunskap om de mekanismer som är involverade i tandlossning avsevärt under de senaste två decennierna. Trots detta, på grund av komplexiteten av parodontala sjukdomar, finns deten pågående debatt om karaktären av det lokala immunförsvaret underlättar vävnadsdestruktion. Det finns också en brist i vår förståelse för funktionen av centrala immunceller i tandköttet under parodontala sjukdomar. Det är därför viktigt att studera patologiska inflammatoriska händelser som inträffar i målvävnaden av sjukdomen, tandköttet.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Comments (optional)</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Company</td>
 <td>Name of the reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>CLS-2</td>
 <td>Worthington Biochemical Corp.</td>
 <td>Collagenase Type II</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>DN25-1G</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>DNAse I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>E6758-100G</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>EDTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>D8537</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat Inactivated</td>
 <td>04-121-1</td>
 <td>Biological Industries</td>
 <td>Fetal Bovine Serum </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>FPE-204-500</td>
 <td>Jet Biofil</td>
 <td>Vacuum-Driven Filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>352052</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>93070</td>
 <td>SPL Lifesciences</td>
 <td>Cell Strainer 70 &mu;m</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>153066</td>
 <td>NUNC</td>
 <td>Tissue Culture Dish 35&times;10 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>554714</td>
 <td>BD</td>
 <td>BD Cytofix/Cytoperm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone N418</td>
 <td>117305</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD11c antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 104</td>
 <td>109819</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD45.2 antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone GK1.5</td>
 <td>100413</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD4 antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 53-6.7</td>
 <td>100733</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD8a antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 17A2</td>
 <td>100214</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD3 antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone G8.8</td>
 <td>118219</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 929F3.01</td>
 <td>DDX0362D</td>
 <td>Imgenex</td>
 <td>Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 39-10-8</td>
 <td>115010</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>LSR II Flow Cytometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Tree Star</td>
 <td>FlowJo Software v 7.6.5</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation, processing and analysis of murine gingival cells

Vi har utvecklat en teknik för att exakt isolera och bearbeta murina tandköttsvävnad för flödescytometri och molekylära studier. Tandköttet är en unik och viktig vävnad att studera immunmekanismer eftersom det är inblandat i värdens immunsvar mot oral biofilm som kan orsaka parodontala sjukdomar. Vidare möjliggör närhet av tandköttet till alveolär benvävnad studerar också benremodelleringen enligt inflammatoriska tillstånd. Vår metod ger stora mängder av immunceller som tillåter analys av även sällsynta cellpopulationer såsom Langerhans celler och T reglerande celler som vi visat tidigare 1. Anställa möss för att studera lokala immunsvar involverade i alveolarbenförlust under parodontala sjukdomar är fördelaktig på grund av tillgängligheten av olika immunologiska och experimentella verktyg. Ändå, på grund av sin ringa storlek och den relativt obekvämt tillgång till den murina gingiva, undvek många studier undersökning av This kritiska vävnad. Den metod som beskrivs i detta arbete skulle kunna underlätta gingival analys, vilket förhoppningsvis kommer att öka vår underskatta den muntliga immunförsvaret och dess roll under parodontala sjukdomar.

Exempel på flödescytometrianalys på gingivala celler presenteras. Gingival celler poolade från 2 möss kördes i en LSR II flödescytometer och analyseras med hjälp FlowJo programvara. Figur 3A visar fördelningen av gingival celler från naiva möss i en sidospridning (SSC) relativt framåtspridning (FSC) tomt. Gating strategi för att identifiera (i) lymfocyter (ii) monocyter / dendritiska celler samt (iii) granulocyter är indikerad. För jämförelse ändamål, presenterar vi också en FACS plo...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells at JoVE.com

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Denna studie beskriver en effektiv teknik för att isolera och behandla gingival vävnad från mus munhålan för att producera en enda cellkultur. De resulterande cellerna kan vidare användas för flödescytometrianalys och molekylära studier.

Isolering, bearbetning och analys av murina Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flödescytometrisk analys av immunceller Inom Murine artärer

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifiering och rening av murina Thymic epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolering av murint Lymph Node stromaceller

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Isolering av Murina peritoneala makrofager att utföra genuttrycksanalys Vid Toll-like receptorer Stimulering

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolering och flödescytometrisk analys av immunceller från ischemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering och flödescytometrisk analys av gliom-infiltrera perifera mononukleära blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Isolering, karakterisering och funktionella Undersökning av tandkötts Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Isolering och aktivering av murina lymfocyter

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolering och flödescytometrisk analys av Human Endocervikala Gamma Delta T-celler

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Rötning av murina levern för ett flöde flödescytometrisk analys av lymfatiska endotelceller

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...