Name: application of an in vitro dna protection assay to visualize stress mediation properties of the dps protein
Uploaded: 2013-05-31T13:00:00
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Somos gratos a Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, e Kourosh Honarmand Ebrahimi para discussões úteis. Este trabalho foi apoiado por fundos start-up da Universidade Delft de Tecnologia.

1. Dps Expressão e purificação Obtenção de proteína de alta pureza é um primeiro passo essencial para o ensaio de protecção de ADN. A purificação da proteína pode ser realizada Dps em 4 a 5 dias. <ol><li> Transformar uma estirpe de protease deficiente de E. coli (tal como BL21 (DE3) pLysS), com um vector pET (por exemplo, pET17) na qual a sequência de codificação de proteína Dps foi clonado. </li><li> Streak as células transformadas para fora em Caldo (LB) ágar L...

<ol>
	<li>Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+DNA-binding+protein+with+regulatory+and+protective+roles+in+starved+Escherichia+coli.">A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli.</a> Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).</li><li>Chiancone, E., Ceci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+capacity+of+Dps+proteins+to+combat+bacterial+stress+conditions:+Detoxification+of+iron+and+hydrogen+peroxide+and+DNA+binding.">The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding.</a> Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).</li><li>Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase-dependent+variation+in+protein+composition+of+the+Escherichia+coli+nucleoid.">Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid.</a> J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).</li><li>Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+repression+by+Fis+and+H-NS+at+the+Escherichia+coli+dps+promoter.">Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter.</a> Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).</li><li>Martinez, A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+DNA+during+oxidative+stress+by+the+nonspecific+DNA-binding+protein+Dps.">Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps.</a> J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).</li><li>Nair, S., Finkel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dps+protects+cells+against+multiple+stresses+during+stationary+phase.">Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase.</a> J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).</li><li>Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+Dps,+a+ferritin+homolog+that+binds+and+protects+DNA.">The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA.</a> Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).</li><li>Zhao, G., Ceci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+and+hydrogen+peroxide+detoxification+properties+of+DNA-binding+protein+from+starved+cells.+A+ferritin-like+DNA-binding+protein+of+Escherichia+coli.">Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).</li><li>Ceci, P., Cellai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+condensation+and+self-aggregation+of+Escherichia+coli+Dps+are+coupled+phenomena+related+to+the+properties+of+the+N-terminus.">DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus.</a> Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).</li><li>Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+incorporation+into+Escherichia+coli+Dps+gives+rise+to+a+ferritin-like+microcrystalline+core.">Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core.</a> J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).</li><li>Swift, J., Wehbi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+functional+ferritin-like+proteins+with+hydrophobic+cavities.">Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).</li><li>Ceci, P., Chiancone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+iron+oxide+nanoparticles+in+Listeria+innocua+Dps+(DNA-binding+protein+from+starved+cells):+a+study+with+the+wild-type+protein+and+a+catalytic+centre+mutant.">Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant.</a> Chemistry. 16 (2), 709-717 (2010).</li><li>Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dps+protein+of+Agrobacterium+tumefaciens+does+not+bind+to+DNA+but+protects+it+toward+oxidative+cleavage:+x-ray+crystal+structure,+iron+binding,+and+hydroxyl-radical+scavenging+properties.">The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).</li><li>Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+so-called+Listeria+innocua+ferritin+is+a+Dps+protein.+Iron+incorporation,+detoxification,+and+DNA+protection+properties.">The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties.</a> Biochemistry. 44 (15), 5572-5578 (2005).</li><li>Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+Koelreuteria+paniculata+Laxm.+on+oxidative+stress+and+hydrogen+peroxide-induced+DNA+damage.">Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage.</a> Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).</li><li>Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radical+scavenging,+DNA+protection,+and+inhibition+of+lipid+peroxidation+mediated+by+uric+acid.">Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).</li><li>Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+role+of+Fur+proteins:+FurB+(All2473)+from+Anabaena+protects+DNA+and+increases+cell+survival+under+oxidative+stress.">New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress.</a> The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).</li><li>Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+and+stimulation+of+formation+of+the+ferroxidase+center+and+the+iron+core+in+Pyrococcus+furiosus+ferritin.">Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).</li><li>Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+iron+determination+using+ferene+triazine.">Serum iron determination using ferene triazine.</a> Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).</li></ol>

O processo de purificação de Dps, conforme descrito neste artigo é muito robusto. Pureza tem sido consistentemente alta (&gt; 99%), não aparecem outras proteínas em gel de SDS-PAGE como bandas visíveis. Apesar disso, alguns lotes de Dps purificados parecem ter actividade de nuclease, tal como evidenciado pela degradação parcial de ADN quando incubadas com concentrações muito elevadas de Dps. Isto pode indicar a presença de ADNases altamente activos em baixa concentração que não fomos capazes de remover por...

Os organismos aeróbios deve constantemente competir com as espécies de oxigénio reactivas que podem danificar o DNA, bem como outras macromoléculas biológicas importantes. Uma ferramenta potente para neutralizar os efeitos tóxicos do dano oxidativo é a proteína de ligação de ADN a partir de células de privação (SAD). Desde a sua descoberta, em 1992, a partir de fome E. coli, uma cultura, Dps foi identificado em mais de 300 espécies de bactérias e 2 arqueobactérias. Regulação positiva maciça de Dps durante a fase estacionária torna a proteína nucleoid associada mais alta expressão de E. coli em condições de fome 3, 4. Além disso, tem sido mostrado Dps para preservar tanto a viabilidade bacteriana e da integridade do ADN durante muitos várias tensões, incluindo a fome, a elevada concentração de ferro, a exposição à luz UV, choque térmico, e do stress oxidativo 5, 6. Estruturalmente, Dps de auto-associados em um complexo estável homo-oligoméricas de 12 monômeros, which montar em uma concha vazia esférica. A ~ 4,5 nm de largura cavidade interna é acessível ao solvente através dos poros, que permitem a passagem de moléculas pequenas 7 o exterior, e que pode sequestrar metais, tais como ferro mineralizados 8. O efeito protetor do Dps deriva das suas diversas atividades bioquímicas, que incluem DNA não específico de ligação 1, atividade ferroxidase e armazenamento de ferro 8. Estudo detalhado das atividades bioquímicas benéficas Dps requer primeiro a sua purificação. Dps purificação é um procedimento elaborado, como PD devem ser separadas não apenas a partir de outras proteínas, mas também a partir de qualquer DNA ligado 7. O nosso processo de purificação optimizado utiliza várias técnicas comuns, que consiste em duas colunas de permuta iónica e um passo de precipitação com sulfato de amónio. Várias trocas de buffer são necessários, como Dps altamente concentrado pode precipitar para fora da solução em condições de pouca sal. Uma vez que a proteína foi purificada Dps, Pode ser aplicada a ensaios que medem directamente a sua actividade ferroxidase 8, estequiometria de ligação de ADN 9, e os mecanismos de ligação do ferro 10. Purificados Dps também tem outras aplicações potenciais. A estrutura esférica oca estável de Dps tem sido utilizado como andaime para armazenar partículas hidrofóbicas da proteína dentro da cavidade 11 e mesmo como uma câmara de reacção para sintetizar novas nanopartículas magnéticas 12. A capacidade de proteção de Dps para mediar danos devido a espécies reativas de oxigênio pode ser clara e diretamente demonstrado usando o ensaio de proteção DNA 13, 14. Neste procedimento in vitro, as espécies de radicais são produzidos quando o ferro catalisa H 2 O 2 a degradação química de Fenton. Estes radicais danificar directamente o ADN presente na reacção e pode degradar completamente em concentrações elevadas. Duas atividades principais Dps pode tanto contrariar diretamente os efeitos da Fenta produção do radical a-mediada. Dps reduz a concentração de ferro catalítico da mineralização, o consumo do peróxido de hidrogénio disponível no processo. Além disso, a ligação ao DNA Dps potencialmente pode protegê-lo fisicamente dos danos dos radicais e condensa-lo em um volume menor com menos área de superfície reativa. A combinação destas duas propriedades faz com que o ensaio de protecção de DNA adequado para a finalidade de medir a actividade protectora Dps. O ensaio de protecção de ADN é bastante versátil e pode ser usado para uma variedade de aplicações para além Dps caracterização. Os danos dos radicais é uma forma comum de estresse em células, e muitas proteínas e substâncias químicas diferentes são usados ​​para combatê-la. O princípio geral do ensaio, utilizando-se a integridade do DNA como um marcador para os danos dos radicais, pode ser usado em combinação com quase qualquer reacção de produção de radicais livres ou agente de neutralização. Entre outros, o ensaio tem sido usado com sucesso para determinar as propriedades anti-oxidantesde K. extrato paniculata para uso na indústria de alimentos 15, para caracterizar os efeitos do ácido úrico em hidroxila mediação dano 16, e para ganhar novos insights sobre a função da pele proteínas reguladoras da transcrição 17. Apesar dos inúmeros usos do ensaio nos trabalhos publicados, descobrimos que muitos optimização e foram necessários passos de resolução, o que torna a criação de ensaio pela primeira vez um processo desnecessariamente trabalhoso para muitos investigadores. O protocolo que apresentamos neste artigo tem como objetivo eliminar essa barreira para a entrada.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3)pLysS competent cells</td>
 <td>Promega</td>
 <td>L1195</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET-17b DNA</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>69663-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB broth powder</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>L3022</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ampicillin sodium salt</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A0166</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C0378</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>I6758</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>BDH</td>
 <td>441476L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium hydroxide</td>
 <td>Merck</td>
 <td>105033</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium chloride</td>
 <td>VWR</td>
 <td>443824T</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E9884</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease Inhibitor Cocktail Set III</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>539134</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEAE-Sepharose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>DFF100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium sulphate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A4418</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PD-10 Desalting Columns</td>
 <td>GE Healthcare LS</td>
 <td>17-0851-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SP-Sepharose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S1799</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO)</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ferrous Sulphate heptahydrate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F8048</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen peroxide solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>216763</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MOPS</td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>475898</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SDS solution</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>161-0418</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethidium bromide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E1510</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Model</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Static incubator</td>
 <td>Hettich</td>
 <td>INE500</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Shaking Incubator </td>
 <td>New Brunswick Sc.</td>
 <td>Inova 44</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cooled centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Avanti J-E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5424</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell disrupter</td>
 <td>Constant Systems Ltd.</td>
 <td>TS2/40/AA/AA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FPLC Purifier</td>
 <td>General Electric</td>
 <td>AKTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airtight vials</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>EW-08918-85</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe needles</td>
 <td>BD</td>
 <td>305128</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipettes</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>Z683779-1EA, Z683795-1EA</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

application of an in vitro dna protection assay to visualize stress mediation properties of the dps protein

O estresse oxidativo é um subproduto inevitável da vida aeróbica. Oxigênio molecular é essencial para o metabolismo terrestre, mas também participa em muitas reações prejudiciais dentro de organismos vivos. A combinação do metabolismo aeróbio e de ferro, que é outro composto vital para a vida, é suficiente para produzir radicais com a química de Fenton e degradar os componentes celulares. Degradação do DNA é sem dúvida o processo mais prejudicial envolvendo radicais intracelulares, como reparo de DNA está longe de ser trivial. O ensaio apresentado neste artigo oferece uma técnica quantitativa para medir e visualizar o efeito de as moléculas e enzimas sobre os danos de DNA mediada por radicais. O ensaio de proteção DNA é uma ferramenta simples, rápido e robusto para a caracterização in vitro das propriedades protetoras das proteínas ou produtos químicos. Isto envolve a exposição do ADN a uma reacção de oxidação prejudicial e adicionando várias concentrações do composto de interesse. A redução ou o aumento de danos no ADN, como uma função da concentração do composto é então visualizada utilizando electroforese em gel. Neste artigo, demonstrar a técnica do ensaio de protecção de DNA medindo as propriedades de protecção da proteína de ligação de ADN a partir de células de privação (SAD). Dps é uma mini-ferritina, que é utilizado por mais de 300 espécies bacterianas para combater poderosamente agressões ambientais. Aqui apresentamos o protocolo de purificação Dps e as condições de ensaio optimizado para avaliar a proteção do DNA por Dps.

O processo de purificação para Dps descritos aqui é muito reprodutível. Dps de purificação de acordo com o protocolo descrito, utilizando-se 2 L de E. cultura coli como um ponto de partida, normalmente produzir 2,5 ml de proteína contendo Dps 12 em concentrações entre 5 e 12 mM. Tempos de indução mais longas (4 horas) parecem reduzir essa variabilidade. Pureza da proteína é consistentemente superior a 99%, como evidenciado por SDS-PAGE, os géis (Figura 1). O n?...

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Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

A proteína de ligação ao DNA de células famintas (SAD) desempenha um papel crucial no combate ao stress bacteriana. Este artigo discute a purificação da<em&gt; E. coli</em&gt; Dps eo protocolo para um<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio demonstrando proteção Dps mediada por DNA da degradação pelas espécies reativas de oxigênio.

A aplicação de um<em&gt; In vitro</em&gt; DNA Assay Proteção ao Visualize Propriedades Mediação stress do Dps Protein

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