Name: determination of microbial extracellular enzyme activity in waters, soils, and sediments using high throughput microplate assays
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00
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Financiamento para aspectos deste trabalho foi fornecida por várias fontes, incluindo o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos Acordo de Cooperação específico 58-6408-1-595 ea National Science Foundation (prêmio 1.049.911).

Colorimétrico Análise da atividade da enzima extracelular em solos e sedimentos 1. Preparação do Substrato e Soluções Tampão de Análises colorimétrica de atividade enzimática <ol><li> H preparar 50 mM de tampão de acetato (pH 5,0-5,5) por mistura de 50 ml de 0,1 M de ácido acético (2,87 ml de ácido acético glacial em 500 ml de água), 150 ml de 0,1 M de acetato de sódio, e 200 ml de água destilada 2 O. Ajustar o pH para 5,0-5,5 com ácido acético 0,1 M, se necess?...

<ol>
	<li>Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+of+microbial+cellulose+degradation.">Ecology of microbial cellulose degradation.</a> Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).</li><li>Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wood+decomposition+over+a+first-order+watershed:+mass+loss+as+a+function+of+lignocellulase+activity.">Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity.</a> Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).</li><li>Dalal, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soil+heavy+metal+concentrations,+microbial+biomass+and+enzyme+activities+in+a+contaminated+grassland+ecosystem.">Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem.</a> Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).</li><li>Olander, L. P., Vitousek, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+soil+phosphatase+and+chitinase+activity+by+N+and+P+availability.">Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability.</a> Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).</li><li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+salinity+and+nutrient+enrichment+on+microbial+assemblages+in+Louisiana+wetland+sediments.">Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments.</a> Wetlands. 29, 277-287 (2009).</li><li>Hoppe, H. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+exoenzymatic+activities+in+the+ecology+of+brackish+water:+measurements+by+means+of+methylumbelliferyl-substrates.">Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates.</a> Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).</li><li>Somville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+study+of+substrate+specificity+of+exoglucosidase+activity+in+eutrophic+water.">Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water.</a> Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).</li><li>Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorogenic+substrates+for+measuring+enzyme+activity+in+peatlands.">The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands.</a> Plant and soil. 175, 147-152 (1995).</li><li>Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+analysis+of+riverine+bacterioplankton+production.">Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production.</a> Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).</li><li>Marx, M. -. C., Wood, M., Jarvis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microplate+fluorometric+assay+for+the+study+of+enzyme+diversity+in+soils.">A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils.</a> Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).</li><li>Jackson, C. R., Weeks, A. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+bacterial+community+structure+in+aquatic+sediments+as+revealed+by+16S+rRNA+gene+sequence+analysis.">Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis.</a> Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).</li><li>Canion, A. K., Ochs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+population+dynamics+of+freshwater+armored+dinoflagellates+in+a+small+lake+in+Mississippi.">The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi.</a> Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).</li><li>Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+soil+enzyme+activity+at+global+scale.">Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale.</a> Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).</li><li>Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+enzyme+activities+as+indicators+of+organic+matter+processing+rates+in+a+Lake+Erie+coastal+wetland.">Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland.</a> Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).</li><li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+activity+and+decomposition+of+fine+particulate+organic+matter+in+a+Louisiana+cypress+swamp.">Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp.</a> Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).</li><li>Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+changes+with+depth+in+microbial+communities+in+a+tropical+Malaysian+peat+swamp+forest.">Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest.</a> Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).</li><li>Rietl, A. J., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+ecological+restoration+practices+of+prescribed+burning+and+mechanical+thinning+on+soil+microbial+enzyme+activities+and+leaf+litter+decomposition.">Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).</li><li>Smart, K. A., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+scale+patterns+in+microbial+extracellular+enzyme+activity+during+leaf+litter+decomposition+in+a+stream+and+its+floodplain.">Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain.</a> Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).</li></ol>

Determinar a atividade de uma variedade de enzimas extracelulares microbianas em solos e sedimentos pode fornecer informações úteis sobre as taxas de mineralização de nutrientes e processamento de matéria orgânica 17. No entanto, os solos podem variar em seus níveis de umidade, por isso é importante para padronizar a atividade de peso seco de solo. Isso requer uma etapa de secagem adicional (normalmente de dois dias) além de simplesmente medir a atividade da enzima. Assim, em contraste com os ensaio...

Os microrganismos, tais como bactérias e fungos obter nutrientes e de carbono a partir de compostos orgânicos complexos, através da produção de enzimas extracelulares. Estas enzimas normalmente hidrolisar polímeros em subunidades menores que podem ser tomadas para a célula. Portanto, a nível ecológico, estas enzimas extracelulares microbianos são responsáveis ​​por grande parte da mineralização de nutrientes e decomposição da matéria orgânica, que ocorre em ambientes naturais. Enzimas tais como celobiohidrolase (CBH) e β-glucosidase são importantes para a degradação da celulose e do trabalho em uníssono para catalisar a hidrólise da celulose em glicose 1,2, o que proporciona um substrato de carbono utilizáveis ​​para a absorção e assimilação microbiana. A fosfatase enzima libera grupos fosfatos inorgânicos solúveis de organofosforados, essencialmente mineralização de fosfato e tornando-o disponível para uso pela maioria dos organismos 3. Outros enzimas, tais como a N-acetilglucosaminidase (NAGase), são important na degradação da quitina e pode fazer tanto carbono e nitrogênio disponível para aquisição microbiana 4. Um dos procedimentos para o ensaio da atividade enzimática extracelular microbiana em ambientes naturais é o uso de p-nitrofenil artificial (p NP) substratos ligados, uma abordagem que foi originalmente desenvolvido para detectar a atividade da fosfatase do solo 5. Esta abordagem baseia-se na detecção de um produto final colorido, p-nitrofenol, o qual é libertado, quando o substrato artificial é hidrolisado pela enzima apropriada. O p-nitrofenol pode ser subsequentemente quantificados colorimetricamente através da medição da sua absorvância de cerca de 400-410 nm. Este método já foi utilizada para a detecção de outras enzimas tais como a NAGase 6, e tem sido utilizado em vários estudos procurando a actividade enzimática extracelular microbiana no solo e nos sedimentos 7-9. Uma abordagem alternativa que era originally desenvolvido para avaliar a actividade de glicosidase extracelular em ambientes aquáticos 10,11 faz uso de 4-metilumbeliferona (MUB) substratos ligados. O produto final libertada (4-metilumbeliferona) é altamente fluorescente e pode ser detectada usando um fluorómetro, com uma configuração de excitação / emissão em torno de 360/460 nm. Uma variedade de substratos artificiais MUB-ligadas estão disponíveis, permitindo a medição fluorométrico da actividade de, pelo menos, como muitas enzimas (por exemplo, β-glicosidase, celobiohidrolase, Nagase, fosfatase), como pode ser testada utilizando o procedimento colorimétrico NP-substrato p. Outras enzimas extracelulares microbianos, tais como a leucina-aminopeptidase proteína-degradante, pode ser ensaiada fluorometricamente utilizando 7-amino-4-metilcumarina (COU) substratos ligados. Ambos MUB-e substratos COU-ligados foram utilizados para determinar a actividade da enzima em diferentes amostras terrestres e aquáticos 12,13. Embora estudos anteriores têm described microplaca fluorométrica ou colorimétrico abordagens para determinar a atividade da enzima extracelular 14, há uma necessidade de uma apresentação clara de como conduzir tais ensaios. Aqui demonstramos procedimentos para a realização de técnicas de alto rendimento de microplacas para a análise da atividade da enzima extracelular em solos e sedimentos, utilizando a abordagem de substratos ligados ao NP p colorimétrico e em águas naturais usando o MUB fluorescente ligada técnica substratos. Nós nos concentramos na medição das atividades de β-glicosidase, NAGase e fosfatase como essas enzimas pode ser amarrado ao carbono, nitrogênio, fósforo e ciclismo, respectivamente. No entanto, os processos descritos aqui podem ser aplicados para a medição de outras enzimas extracelulares usando diferentes substratos artificiais.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS AND MATERIALS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP612-1</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3234</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7006</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N9376</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Clear 96-well microplates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-563-301</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96-well deep well blocks</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3958</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Aluminum weigh pans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 15 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8883</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3633</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2133</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96-well microplate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3792</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette reservoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-81</td>
			<td>For microplates/deep-well blocks</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate fluorometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>FLx 800</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>8-channel pipettor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of microbial extracellular enzyme activity in waters, soils, and sediments using high throughput microplate assays

Grande parte da ciclagem de nutrientes e processamento de carbono em ambientes naturais ocorre através da atividade de enzimas extracelulares produzidos por microorganismos. Assim, a medição da atividade dessas enzimas extracelulares pode dar insights sobre as taxas de processos de nível do ecossistema, como a decomposição da matéria orgânica ou de azoto e de mineralização do fósforo. Os ensaios de actividade da enzima extracelular em amostras ambientais tipicamente envolver a exposição das amostras de substratos colorimétricos ou fluorométricos artificiais e rastreando a taxa de hidrólise do substrato. Aqui nós descrevemos os métodos em microplacas para estes procedimentos que permitem a análise de um grande número de amostras dentro de um curto espaço de tempo. As amostras são deixados reagir com substratos artificiais dentro microplacas de 96 poços ou de poço profundo blocos de microplacas, e a actividade da enzima é subsequentemente determinada por absorção ou fluorescência do produto final resultante utilizando uma microplaca Reade típicor ou fluorímetro. Tais procedimentos de alto rendimento não só facilitar as comparações entre os locais ou ecossistemas espacialmente separadas, mas também reduzir substancialmente o custo de tais ensaios, reduzindo os volumes totais de reagentes necessários por amostra.

Solos e sedimentos aquáticos têm tipicamente níveis apreciáveis ​​de actividade da enzima extracelular, como resultado de comunidades microbianas acoplados (biofilmes) que crescem na superfície das partículas. Figura 3 mostra como esta actividade muda dependendo do tamanho das partículas obtidas a partir da superfície do sedimento de um terceiro fluxo de ordem no norte Mississippi, EUA. Um estudo anterior demonstrou que as comunidades bacterianas em partículas de sedimentos deste fluxo pode...

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Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Procedimentos em microplacas são descritos para a análise colorimétrica ou fluorimétrica da atividade da enzima extracelular. Estes procedimentos permitem o rápido ensaio de tal atividade em um grande número de amostras ambientais dentro de um prazo administrável.

Determinação da Microbial Extracelular Enzyme actividade nas águas, solos e sedimentos, utilizando alta taxa de transferência de microplaca Ensaios

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Research

JoVE Journal

Environment

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

De alta capacidade Fluorometric Medição do Potencial dos Solos extracelulares atividades enzimáticas

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Ambiente

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Medição do fluxo de gases com efeito de Solos Agrícolas Usando Chambers estáticos

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

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