Name: pyrosequencing for microbial identification and characterization
Uploaded: 2013-08-22T12:00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization at JoVE.com

وكان هذا المشروع دعما جزئيا من قبل جامعة جونز هوبكنز، مكتب وكيل الجامعة من خلال مبادرة العلوم وبوابة QIAGEN شركة

مقدمة: مستعمرة بكتيرية واحدة ينبغي أن تستخدم لتطعيم مرق ثقافة المناسبة التي حضنت بين عشية وضحاها. ثم تتم معالجة بيليه البكتيرية لتنقية الحمض النووي الجيني باستخدام المتاحة تجاريا الجيني عدة العزلة. الحمض النووي الجيني تنقية ينبغي أن يكون لها نسبة 260/280 (نانومتر)&gt; 1.8 لضمان أن تكون العينة خالية من التلوث البروتين. كمية من الحمض النووي الجيني اللازمة لتوليد القالب pyrosequencing هو 10-20 نانوغرام. A. التضخيم من قالب (PyroMark PCR الدليل؛ <a href="http://www.qiagen.com/handbooks" target="_blank">www.qiagen.com / كتيبات</a> 1) إعداد رد فعل PCR ملاحظة: يجب أن البيروكسيديز واحد التمهيدي في نهاية ه 5 &#39;، ووينصح أن يكون HPLC المنقى لإعداد القالب. نوصي PyroMark الفحص تصميم البرمجيات 2.0 ل PCR وSEquence التصميم التمهيدي التي هي الأمثل لفترة قصيرة للقراءة التسلسل، ومع ذلك، التمهيدي للانفجارات ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi؟LINK_LOC=BlastHome</a> يمكن) من NCBI أيضا أن تستخدم لتصميم التمهيدي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد كل الحلول المطلوبة (المذكورة في الجدول 1) وتخلط كل بدقة. إعداد رد فعل وفقا للجدول 1. ويمكن أن يتم كل العمل في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> ملاحظة: PCR ماجستير ميكس يحتوي MgCl 2 لتركيز النهائي من 1.5 ملم، والتي توفر نتائج مرضية في معظم الحالات. إذا كان أعلى 2 ملغ مطلوب + تركيز، وتصل إلى 3.5 ميكرولتر من 25 ملم MgCl 2 يمكن أن تضاف إلى رد فعل. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلط جيدا مزيج رد فعل من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا، ثم الاستغناء عن وحدات التخزين المناسبة في أنابيب PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة templatه الحمض النووي لكل أنبوب PCR. ونحن نوصي 10 نانوغرام من الحمض النووي الجيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج cycler الحرارية وفقا للجدول 2. A عقد النهائي في 4 درجات مئوية لمدة ينصح الراحة. إذا باستخدام cycler الحرارية دون غطاء ساخنة، وردود الفعل تراكب مع 100 ميكرولتر الزيوت المعدنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب PCR في cycler وبدء برنامج ركوب الدراجات. </li></ol> B. البروتوكول محطة فراغ شل حركة المنتجات PCR البيروكسيديز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل مزيج الرئيسي وفقا لالرقم 4. </li></ol> ملاحظة: قبل pipetting ل، هز بلطف زجاجة من الخرز سيفاروز streptavidin المغلفة لضمان تعليق متجانسة. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على حجم المنتج PCR المستخدمة، الاستغناء 60-75 ميكرولتر مزيج الرئيسي في كل بئر من لوحة PCR لإعطاء حجم ما مجموعه 80 ميكرولتر لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5-20 ميكرولتر منتج PCR البيروكسيديز إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اغلاق الآبار مع قطاع CAPS وتستنهض الهمم لوحة PCR في 1،400 دورة في الدقيقة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) باستخدام شاكر المداري. </li></ol> تمسخ من الحمض النووي وبالإضافة إلى ذلك من تسلسل التمهيدي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الاشعال التسلسل إلى 0.3 ميكرومتر مع الصلب العازلة والاستغناء عن 25 ميكرولتر في كل بئر من لوحة رد فعل. وضع لوحة على محطة العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أحواض محطة العمل وفقا لمخطط الشكل 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مضخة فراغ، وتأكد من ضبط المفتاح على أداة فراغ لفي (الشكل 6). مسح تحقيقات مع فلتر المياه عالية النقاء (ملي-Q 18.2 ميغاواط X سم أو ما يعادلها) في الحوض الصغير 5 (الشكل 5). إعادة ملء الحوض بالماء عالية النقاء العذبة للاستخدام في الخطوة 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل بسرعة، ووضع لوحة PCR مع الخرز على محطة العمل. ضمان أن كلا من لوحات في نفس التوجه كما هو الحال عندما تم تحميل العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع التبديل فراغ ON، خفض الفراغأداة في الآبار من لوحة PCR لمدة 20 ثانية أو حتى تم يستنشق كل حجم. سوف يتم القبض على حبات من قبل أداة فراغ (الشكل 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الفراغ لا يزال ON، تدفق أداة مع الايثانول 70٪ (الحوض الصغير 1) لمدة 20 ثانية أو حتى تم يستنشق كل حجم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع فراغ ON، تدفق أداة مع حل تمسخ (حوض 2) لمدة 20 ثانية أو حتى تم يستنشق كل حجم. </li></ol> ملاحظة: يحتوي الحل تمسخ هيدروكسيد الصوديوم، الذي هو العين وأنسجة الجلد. دائما ارتداء معطف المختبر، والقفازات، ونظارات واقية. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع فراغ ON، تدفق أداة مع غسل العازلة (الحوض الصغير 3) لمدة 20 ثانية أو حتى تم يستنشق كل حجم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع فراغ ON، رفع أداة الفراغ الى ما بعد 90 درجة عمودي لمدة 5 ثوانى، للسماح لجميع السائل إلى استنزاف للخروج من أداة فراغ. تحويل مضخة OFF، ومحاذاة أداة فراغ مع لوحة رد فعل. أخفض أداة فراغ فيالآبار ويهز بلطف من جانب إلى آخر للافراج عن الخرز في الآبار التي تحتوي على تسلسل التمهيدي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل تنظيف أداة فراغ، تستنهض الهمم تحقيقات مرشح في المياه عالية النقاء (الحوض الصغير 4) لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل ON فراغ ومسح أداة بالماء عالية النقاء (حوض 5) لمدة 20 ثانية أو حتى تم يستنشق كل حجم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع أداة الفراغ الى ما بعد 90 ° C عمودي لمدة 5 ثوانى، ثم التبديل الفراغ من وتخزينها في موقف &quot;انتظار&quot;. </li></ol> الصلب التمهيدي لتسلسل الحمض النووي مسارات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة رد فعل في حامل لوحة قبل تحسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين لوحة على كتلة التدفئة في 80 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة من حامل ووضعت على وصفة طبية لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li></ol> Pyromark Q24 عملية ملاحظة: شغل أداة باستخدام مفتاح الطاقة الموجود أعلى سلك الطاقة. نجمةكبش يمكن أن يستغرق فترة تصل الى 1 دقيقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء خرطوشة وفقا للتعليمات الواردة في PyroMark الذهب Q24 الكواشف الدليل (2). لتحديد حجم الحاجة، إعداد ملف تشغيل في البرنامج الصك، وضمن القائمة أدوات اختيار تمهيدي معلومات تشغيل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان الصك بالفعل على، تأكد من أنه لا يؤدون شوط ومن ثم فتح الغطاء. سوف تنبعث إشارة تحذير مسموعة إذا تم فتح الغطاء عندما يكون غير آمن للقيام بذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح باب خرطوشة وأدخل خرطوشة مع التسمية متقابلة إلى الأمام (الشكل 8). تأكد من أن خرطوشة يتم إدراج بشكل صحيح (يجب أن يكون خط مرئي في الجبهة) وإغلاق البوابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح إطار لوحة (الفيتو) ووضع لوحة مع عينات داخل الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق إطار لوحة القابضة وغطاء صك (الشكل 9). </li></ol> بدء التشغيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج عصا USB مع ملف التشغيلق إنشاؤها بواسطة هذه البرامج أداة في منفذ USB في مقدمة الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;تشغيل&quot; في القائمة الرئيسية ثم اضغط على &quot;OK&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدم الأسهم التمرير لتحديد ملف التشغيل المطلوب ثم اضغط على &quot;اختيار&quot;. </li></ol> ملاحظة: وسوف تبدأ صك الاستغناء الكواشف عندما يتم التوصل إلى كل الضغوط مسبقا ومستويات درجة الحرارة (قد يستغرق هذا عدة دقائق). خلال شوط، يعرض على الشاشة الصك pyrogram من اختيارها بشكل جيد في الوقت الحقيقي. استخدم الأسهم التمرير لعرض pyrogram من الآبار الأخرى. استكمال تشغيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يؤكد الصك أن يتم الانتهاء من تشغيل وتم حفظ ملف تشغيل إلى عصا USB، اضغط على &quot;إغلاق&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عصا USB. إذا تمت إزالته قبل تشغيل الانتهاء، إدراج عصا USB. حدد &quot;إدارة&quot; ثم &quot;نسخ أشواط غير محفوظ&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن الآن فتح ملف تشغيل وتحليلها باستخدام برنامج الصك ومقارنةإلى مكتبة من الميكروبات المعروفة باستخدام برنامج Identifire. </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark PCR Handbook. , (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark Q24 User Manual. , (2012).</li><li>Elahi, E., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+a+tool+for+DNA+sequencing+analysis.">Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis.</a> Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).</li><li>Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+and+accurate+detection+platform+for+single+nucleotide+polymorphisms.">Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms.</a> Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).</li><li>Langaee, T., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+analyses+by+pyrosequencing.">Genetic variation analyses by pyrosequencing.</a> Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).</li><li>Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+pyrosequencing+reads+suffice+for+accurate+microbial+community+analysis.">Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis.</a> Nucleic Acids Res. 35 (18), e120 (2007).</li><li>Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+Pyrosequencing+for+microbiology:+From+genes+to+genomes.">The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes.</a> J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).</li><li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+microbial+diversity+from+454+pyrosequencing+data.">Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data.</a> Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).</li><li>Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+DNA+sequencing+using+detection+of+pyrophosphate+release.">Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.</a> Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).</li><li>King, C., Scott-Horton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+A+simple+method+for+accurate+genotyping.">Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping.</a> J. Vis. Exp. (11), e630 (2008).</li><li>Rothberg, J. W., Heinz, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-Mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., Fehr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li></ol>

وترعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المقالة عن طريق QIAGEN. المؤلف أحمد، ديروشير، جيسن وفاردي والعاملين في QIAGEN شركة التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

وقد تم تسويقها القليلة المقبلة أساليب جديدة التسلسل جيل. ثلاثة من أكثر الوسائل المستخدمة على نطاق واسع هي أيون تسلسل أشباه الموصلات، واحدة جزيء الحقيقي التسلسل الوقت، وتسلسل عن طريق التخليق (SBS). 3-11 كل من هذه الطرق يعتمد على التسلسل عن طريق التخليق ولكن توظيف المنصات رواية للكشف عن النيوكليوتيدات يدمج. في أيون أشباه الموصلات التسلسل، ضفيرة واحدة من الحمض النووي بمثابة قالب لحبلا التسلسل. 12 البلمرة والنيوكليوتيدات تضاف بالتتابع كما هو الحال في pyrosequencing. عند إضافة النوكليوتيدات إلى حبلا الحمض النووي المتزايد، ويتم تحريرها أيون الهيدروجين. تم الكشف عن أيون الهيدروجين بواسطة تأثير الترانزستور الاستشعار الميدانية. واحد جزيء الحقيقي التسلسل الوقت يعتمد على وضع دليل موجة صفر (كتبها zmw). كتبها zmw 13 هو بنية صغيرة حيث يتم إرفاق جزيء البلمرة واحدة إلى أسفل البئر. يضيء في مثل هذه الطريقة أن فلورويمكن الكشف عن جزيء رائحة. غير الموسومة كل النوكليوتيدات مع جزيء نيون. كما أدرج النوكليوتيدات الموسومة fluorescently، كاشف يحدد النوكليوتيدات. عندما تتم إضافة النوكليوتيدات المقبل، هو المشقوق جزيء الفلورسنت 14 التسلسل عن طريق التخليق (SBS) يستخدم طريقة فريدة من نوعها لتضخيم الحمض النووي المستهدف بحيث يتم إنشاء مجموعات من متواليات فريدة من نوعها. قوالب 15 الذين تقطعت بهم السبل واحدة يتم إنشاؤها ثم يتم تصنيعه حبلا التكميلية. يتم تصنيف كل النوكليوتيدات مع جزيء الفلورسنت وبعد كل إضافة قاعدة يتم تسجيل مضان من قاعدة المضافة.

Pyrosequencing هو طريقة سريعة ودقيقة لتسلسل الأحماض النووية التي تقوم على مبدأ &quot;التسلسل عن طريق التخليق&quot;. &quot;التسلسل عن طريق التخليق&quot; ينطوي على استخدام قالب DNA ضفيرة واحدة لتجميع حبلا التكميلية قاعدة واحدة في وقت واحد، والكشف عن قاعدة أدرجت (A، T، G، أو C) في كل خطوة من خلال الكشف عن إشارة chemiluminescent. يتضمن رد فعل pyrosequencing الحمض النووي القالب، dNTPs (dATP، dGTP، dTTP، dCTP)، البلمرة DNA، ATP sulfurylase، وسيفيرين، وسيفيراز، وآبيراز. يبدأ رد فعل التوليف عن طريق إضافة واحدة من dNTPs أربعة والبلمرة DNA إلى واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي القالب البيروكسيديز. البلمرة DNA يدمج dNTP التكميلية على القالب، مع الافراج اللاحقة من بيروفوسفات (الشكل 1). ATP sulfurylase يحول نسبيا في بيروفسفات إلى ATP. ATP يعمل كمحفز لتحويل وسيفيراز بوساطة من وسيفيرين إلى oxyluciferin، التييولد ضوء (الشكل 2). شدة الضوء يتناسب مع عدد من النيوكليوتيدات أدرجت ويحدد ما إذا كان هو واحد أو أكثر dNTP معينة (dATP، dTTP، dGTP، أو dCTP) موجودة على حبلا قالب بالتسلسل (الشكل 3). أي dNTP الفردية هي التي تدهورت بفعل آبيراز قبل اضافة dNTP المقبل لاستمرار رد فعل التوليف. ويتكرر هذا &quot;التسلسل عن طريق التخليق&quot; رد فعل مع اضافة كل من dNTPs أربعة حتى يتم تحديد تسلسل الحمض النووي من القالب الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد. لعرض الرسوم المتحركة للتفاعل pyrosequencing <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405movie1.mov" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة الفيلم</a> .

<table border=1>
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark PCR Master Mix, 2x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoralLoad Concentrate, 10x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Q-Solution, 5x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2, 25 mM</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-Free Water</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>129112</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978776 or 978777</td>
 <td>Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 &mu;M.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyromark Gold Q24 Reagents</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>970802</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-purity water (Milli-Q 18.2 M&Omega; x cm or equivalent)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>17-5113-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Annealing Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Denaturation Solution</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Wash Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001514</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Cartridge</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979202</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q96 HS Tip Holder Box</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979105</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Vacuum Workstation</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Plate Holder</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9022273</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Orbital shaker</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-675-297</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat block</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-718Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

pyrosequencing for microbial identification and characterization

Pyrosequencing هي تقنية متعددة الاستخدامات التي تسهل تسلسل الجينوم الميكروبي التي يمكن استخدامها لتحديد الأنواع البكتيرية، تميز السلالات البكتيرية وكشف الطفرات الجينية التي تمنح مقاومة العوامل المضادة للميكروبات. وتشمل مزايا pyrosequencing لتطبيقات علم الأحياء الدقيقة سريعة وموثوقة الفرز الفائق الإنتاجية وتحديد دقيق للميكروبات والطفرات الجينية الميكروبية. Pyrosequencing ينطوي على تسلسل الحمض النووي عن طريق تجميع حبلا التكميلية قاعدة واحدة في وقت واحد، مع تحديد كائن النوكليوتيدات محددة أدرجت خلال رد فعل التوليف. يحدث رد فعل على يجمد واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي القالب حيث يتم إضافة ريبوزية أربعة (dNTP) بالتسلسل وdNTPs الفردية هي المتدهورة إنزيمي قبل اضافة dNTP بجانب رد فعل التوليف. ويتم رصد الكشف عن قاعدة محددة دمجها في قالب من قبل جيل من chemilumإشارات inescent. ترتيب dNTPs التي تنتج الإشارات chemiluminescent يحدد تسلسل الحمض النووي للقالب. القدرة التسلسل في الوقت الحقيقي التكنولوجيا pyrosequencing يمكن تعريف الميكروبي السريع في فحص واحد. وبالإضافة إلى ذلك، الصك pyrosequencing، يمكن تحليل التنوع الجيني الكامل لمكافحة الجراثيم المقاومة للأدوية، بما في ذلك كتابة من تعدد الأشكال، والطفرات نقطة، الإدراج، والحذف، وكذلك الكمي من نسخ الجينات المتعددة التي قد تحدث في بعض المقاومة المضادة للميكروبات أنماط.

نتائج شوط pyrosequencing نموذجي باستخدام برنامج يظهر الموقع من الاشعال إلى الأمام وعكس تستخدم لتوليد AMPLICON، والتمهيدي التسلسل تستخدم للتفاعل pyrosequencing داخل 16S الحفظ تسلسل الريباسي (الشكل 10). تسلسل hypervariable بين التمهيدي مواقع يسمح لتحديد البكتيريا من عدد كبير من الأنواع البكتيرية باستخدام التمهيدي تسلسل الحفظ (5&#39;-TACATGCAAGTCGA). باعتبارها مراقبة الجودة الداخلية، وتسلسل الحمض النووي بين أقواس المنطقة متغير ويمكن التحقق من أن أؤكد أن المنطقة DNA الصحيح وقد تم تحليلها . البرنامج pyrosequencing يسمح للمقارنة ومحاذاة تسلسل ولدت لقاعدة بيانات داخلية من تسلسل الريباسي البكتيرية لتحديد البكتيريا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحليل تسلسل لتحديد الطفرات التي تمنح المضادات الحيوية المقاومة للأدوية. على سبيل المثال، تحليل الطفرات في الجينات 23S الريباسي من Helicobيوضح بيلوري acter نمطين الطفرة (غا أو AGA) التي تمنح المقاومة للمضادات الحيوية (الشكل 11). تحليل عزلات متعددة من نفس المريض يمكن أن يعاير في وقت واحد لتتبع ظهور المقاومة للأدوية على مر الزمن للمساعدة في التحقيقات الوبائية لانتشار الجراثيم المقاومة للأدوية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig1.jpg" /> الشكل 1. يتم استخدام المنتج PCR البيروكسيديز كقالب لدمج dNTPs بواسطة البلمرة DNA، مما يؤدي إلى توليد بيروفوسفات (نقطة في البوصة). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig2.jpg" /> الشكل 2. ATP sulfurylase يحول نسبيا بيروفسفات إلى ATP. أعمال ATP كمحفز لتحويل وسيفيراز بوساطة من وسيفيرين إلى oxyluciferin، الذي يولد الضوء الذي هو برو<html> portional لكمية من ATP. يتم تسجيل النور كما الذروة على تتبع pyrogram ويشير إلى إدماج النوكليوتيدات. وdNTPs الفردية هي التي تدهورت بفعل آبيراز قبل إضافة dNTP المقبل لمواصلة عملية التجميع. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig3.jpg" /> الشكل (3). شدة الضوء ولدت يشير إلى ما إذا تأسست واحد أو أكثر dNTP معينة (dATP، dTTP، dGTP، أو dCTP) على قالب حبلا بالتتابع. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig4.jpg" /> الشكل 4. الرسم البياني لإعداد مزيج الرئيسي لشل حركة المنتج PCR البيروكسيديز. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig5.jpg" /><html> GE = &quot;دائما&quot;&gt; الشكل 5. PyroMark محطة العمل، مع PCR لوحة، لوحة PyroMark، والمواقع الحوض الصغير. <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig6.jpg" /> الشكل (6). مواقع التبديل فراغ ON OFF والمواقف. <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig7.jpg" /> الرقم 7. أداة فراغ. التعامل الصحيح مع أداة فراغ. <img alt="الرقم 8" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig8.jpg" /> الرقم 8. فتح باب خرطوشة مع خرطوشة في مكانها. <img alt="الرقم 9" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig9.jpg" /> الشكل 9. خرطوشة إدخالها بشكل صحيح مع البوابة مغلقة. &quot;FO: المحافظة على together.within الصفحات =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الرقم 10" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig10.jpg" /> الشكل 10. Pyrosequencing نتائج تحديد البكتيريا القائم. صممت الاشعال PCR للمناطق المحمية من القالب الحمض النووي، ويتم وضع تسلسل التمهيدي فورا المنبع من A-تتميز كذلك تحديد تسلسل الحمض النووي hypervariable داخل AMPLICON (كما هو موضح باللون الأزرق). <img alt="الرقم 11" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig11.jpg"/> الشكل 11. الكشف عن المضادات الحيوية المقاومة للأدوية في هيليكوباكتر بيلوري باستخدام pyrosequencing. تحليل الطفرات في الجينات 23S التي تمنح مقاومة للجراثيم في هيليكوباكتر بيلوري التي تحتوي على غا أو متواليات AGA. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405fig11large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr> &lt;TD&gt; مكون </td><td> حجم في رد الفعل </td><td> تركيز النهائي </td></tr><tr><td> بايرو PCR ماجستير ميكس، 2X </td><td> 12.5 ميكرولتر </td><td> 1X </td></tr><tr><td> مركزات CoralLoad، 10X </td><td> 2.5 ميكرولتر </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 25 ملي MgCl 2 (اختياري) </td><td> متغير </td><td> ≥ 1.5 ملم </td></tr><tr><td> Q-الحل، 5X (اختياري) </td><td> 5 ميكرولتر </td><td> 1X </td></tr><tr><td> التمهيدي A / B التمهيدي </td><td> متغير / متغير </td><td> 0.2 ميكرومتر μM/0.2 </td></tr><tr><td> الماء ريبونوكلياز خالية </td><td> متغير </td><td> - </td></tr><tr><td> اجمالى حجم التداول (بعد إضافة الحمض النووي القالب) </td><td> 25 ميكرولتر </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1. PCR تفاعل الخليط. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> &amp; NBSP؛ </td><td></td><td> تعليقات إضافية </td></tr><tr><td> الخطوة الأولي تفعيل PCR </td><td> 15 دقيقة </td><td> 95 ° C </td><td> يتم تنشيط HotStartTaq الحمض النووي البلمرة </td></tr><tr><td> 3 الخطوة الدراجات: تمسخ </td><td> 30 ثانية </td><td> 94 ° C </td><td></td></tr><tr><td> الصلب </td><td> 30 ثانية </td><td> 60 ° C 56 ° C </td><td> لالحمض النووي الجيني لبيسلفيت الحمض النووي تحويلها </td></tr><tr><td> تمديد </td><td> 30 ثانية </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td> عدد دورات </td><td> 45 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> التمديد النهائي </td><td> 10 دقيقة </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 2. PCR دورة المواصفات.

Watch this Scientific Journal Video about Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization at JoVE.com

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing هي تقنية متعددة الاستخدامات التي تسهل تسلسل الجينوم الميكروبي التي يمكن استخدامها لتحديد الأنواع البكتيرية، تميز السلالات البكتيرية، والكشف عن الطفرات الوراثية التي تمنح مقاومة العوامل المضادة للميكروبات. في هذا الفيديو، سيظهر الإجراء لتوليد الميكروبية AMPLICON، AMPLICON pyrosequencing، وتحليل تسلسل الحمض النووي.

Pyrosequencing لتحديد وتوصيف الميكروبية

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

المجتمعات الميكروبية في الطبيعة ومختبر -- مقابلة

Biology of Microbial Communities  - Interview

بيولوجيا المجتمعات الميكروبية -- مقابلة

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing : طريقة بسيطة لالتنميط الجيني دقيقة

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

نافذة على المجهري : نظم ميكروفلويديك بسيطة لدراسة النقل في وسائل الإعلام الميكروبية المسامية

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

تحديد وتوصيف ارتباط بالغليكوزيل باستخدام بروتين معين إندو وexoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

استخدام الكيموستات في الميكروبية بيولوجيا الأنظمة

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

عزل المناطق الجينوم محددة وتحديد أسوشيتد الجزيئات التي enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

نبات مروج التحليل: تحديد وتوصيف للعقيدات الجذرية المروج محددة في الفول المشتركة

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

بروتوكول المصحوبة بمرشدين لتوصيف الجراثيم البراز بتسلسل الرنا الريباسي-Amplicon 16S

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

تحديد وعزل وتوصيف السلف الليفية الشحمية (FAPs) والذرى العضلية المنشأ (أعضاء البرلمان) في العضلات الهيكلية في الجرذ

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...