Name: pyrosequencing for microbial identification and characterization
Uploaded: 2013-08-22T12:00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization at JoVE.com

Dit project was steun voor een deel door de Johns Hopkins University, Bureau van de provoost via de Gateway Science Initiative en Qiagen Inc

Inleiding: Een enkele bacteriekolonie moeten worden gebruikt om een geschikt kweekmedium dat wordt overnacht geïncubeerd inoculeren. Een bacteriële pellet wordt vervolgens op genomisch DNA met behulp van een commercieel verkrijgbare isolatiekit genomische zuiveren. De gezuiverde genomisch DNA zou een verhouding 260/280 (nm) moet&gt; 1,8 te verzekeren dat het monster geen eiwit verontreinigingen. De hoeveelheid genomisch DNA vereist voor het genereren van de pyrosequencing template 10-20 ng. A. Versterking van de Template (PyroMark PCR Handbook; <a href="http://www.qiagen.com/handbooks" target="_blank">www.qiagen.com / handboeken</a> 1) Het opzetten van de PCR-reactie Opmerking: Een primer moet gebiotinyleerd aan het 5&#39;-uiteinde, en het wordt aanbevolen dat het zijn HPLC gezuiverd voor de voorbereiding template. Wij raden de PyroMark Assay Design Software 2.0 voor PCR en seQuence primer ontwerp die zijn geoptimaliseerd voor korte-read sequencing echter Primer-BLAST ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome</a> ) van NCBI kan ook worden gebruikt voor primer design. <ol><li> Dooi alle benodigde oplossingen (vermeld in tabel 1) en meng elk grondig. Stel de reactie volgens tabel 1. Al het werk gedaan kan worden op kamertemperatuur. </li></ol> Opmerking: De PCR Master Mix bevat MgCl2 voor een eindconcentratie van 1,5 mM, die bevredigende resultaten oplevert in de meeste gevallen. Indien een hogere Mg2 + concentratie is vereist, kan tot 3,5 ui 25 mM MgCl2 toegevoegd aan een reactiemengsel. <ol start="2"><li> De reactie mix goed te mengen door voorzichtig en neer te pipetteren, vervolgens afzien adequate volumes over in PCR-buisjes. </li><li> Voeg template DNA aan elke PCR buis. Wij raden aan 10 ng genomisch DNA. </li><li> Programmeer de thermische cycler volgens tabel 2. Een laatste houden bij 4 ° C wordt aanbevolen voor het gemak. Bij gebruik van een PCR-apparaat zonder verwarmde deksel, overlay reacties met 100 ui minerale olie. </li><li> Plaats de PCR-buizen in de cycler en de cyclus te starten programma. </li></ol> B. Vacuum Workstation Protocol Het immobiliseren van het gebiotinyleerde PCR-producten <ol><li> Voeg een master mix volgens figuur 4. </li></ol> Opmerking: Voor het pipetteren, schud de fles streptavidine-gecoate Sepharosekorrels om een homogene suspensie te garanderen. <ol start="2"><li> Afhankelijk van de hoeveelheid PCR-product gebruikt afgeven 60-75 pi Master Mix in elk putje van een PCR plaat tot een totaal volume van 80 gl per putje. </li><li> Voeg 5-20 ul gebiotinyleerde PCR-product aan elk putje. </li><li> Verzegelen van de putten met strip caps en schud de PCR plaat bij 1400 rpm gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur (15-25 ° C) met behulp van een schudapparaat. </li></ol> Denaturatie van DNA en toevoeging van sequentiebepalingsprimer <ol><li> Verdun de sequencing primers met 0,3 uM annealing buffer en 25 pl afzien in elk putje van een reactieplaat. Plaats de plaat op het werkstation. </li><li> Vul het werkstation goten volgens fig. 5 diagram. </li><li> Schakel de vacuümpomp, en zorg ervoor dat de schakelaar op het vacuüm gereedschap is ingeschakeld (Figuur 6). Spoel het filter sondes met een hoge zuiverheidsgraad water (Milli-Q 18,2 MW x cm of gelijkwaardig) in trog 5 (figuur 5). Vul de bak met verse hoogzuivere water voor gebruik in stap 12. </li><li> Snel te werken, de positie van de PCR-plaat met kralen op de werkplek. Controleer of beide platen in dezelfde richting als bij de monsters werden geladen. </li><li> Met de vacuüm-schakelaar ON, verlagen het vacuümGereedschap in de putjes van de PCR-plaat gedurende 20 seconden of tot al volume is afgezogen. De beads worden opgevangen door het vacuüm gereedschap (figuur 7). </li><li> Met het vacuüm nog ON, spoelt u de tool met 70% ethanol (trog 1) gedurende 20 seconden of totdat alle volume is opgezogen. </li><li> Met vacuum ON, spoelt u de tool met denaturatie-oplossing (goot 2) gedurende 20 seconden of totdat alle volume is opgezogen. </li></ol> Opmerking: De denaturatie oplossing bevat natriumhydroxide, die een oog en huidirritatie. Draag altijd een laboratoriumjas, handschoenen en een veiligheidsbril. <ol start="8"><li> Met vacuum ON, spoelt u de tool met wasbuffer (goot 3) gedurende 20 seconden of totdat alle volume is opgezogen. </li><li> Met vacuum ON, verhogen het vacuüm tool om buiten 90 ° verticaal voor 5 seconden, zodat alle vloeistof uit de vacuüm tool. Schakel de pomp uit, en lijn het vacuüm tool met de reactie plaat. Laat de stofzuiger gereedschap in deputten en schud van links naar rechts om de kralen introductie in de putjes die sequencing primer. </li><li> Om het vacuüm hiervan schoon schud het filter probes in hoge zuiver water (goot 4) gedurende 10 sec. </li><li> Schakel de stofzuiger aan en spoel de tool met een hoge zuiverheidsgraad water (trog 5) gedurende 20 seconden of totdat alle volume is opgezogen. </li><li> Hef het vacuüm tool om buiten 90 ° C verticaal voor 5 sec, zet vervolgens de stofzuiger uit en op te slaan in de stand &quot;Park&quot;. </li></ol> Gloeien sequencing primer om DNA-strengen <ol><li> Plaats de reactie plaat in een voorverwarmde plaat houder. </li><li> Verwarm de plaat op een verwarmingsblok bij 80 ° C gedurende 2 minuten. </li><li> Verwijder de plaat uit de houder en plaats op de teller afkoelen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li></ol> Pyromark Q24 Operation Opmerking: Schakel het apparaat met de schakelaar boven de stroomkabel. Stertup kan tot 1 min. <ol><li> Vul een cartridge volgens de instructies in de PyroMark Gold Q24 Reagentia Handboek 2. Om te bepalen volumes nodig, het opzetten van een run-bestand in het instrument software, en onder het menu Extra selecteert Pre Run Informatie </li><li> Als het instrument was al op, ervoor te zorgen dat het niet is het uitvoeren van een run en open vervolgens het deksel. Een akoestisch waarschuwingssignaal zal worden uitgezonden als de deksel wordt geopend wanneer het onveilig is om dat te doen. </li><li> Open de cartridge poort en plaats de cassette met het label naar voren (figuur 8). Zorg ervoor dat de cartridge goed is geplaatst (een lijn moet zichtbaar zijn aan de voorzijde te zijn) en sluit de poort. </li><li> Open de plaathoudende frame en plaats de plaat met samples in het instrument. </li><li> Sluit de plaathoudende frame en het instrument deksel (Figuur 9). </li></ol> Het starten van een run <ol><li> Steek de USB-stick met de run-bestands gemaakt met het instrument software in de USB-poort aan de voorzijde van het instrument. </li><li> Selecteer &#39;Uitvoeren&#39; in het hoofdmenu en druk op &quot;OK&quot;. </li><li> Gebruik de pijltoetsen om het gewenste run bestand te selecteren en druk op &quot;Select&quot;. </li></ol> Opmerking: Het instrument zal beginnen doseren reagentia als alle vooraf ingestelde druk en temperatuur zijn bereikt (dit kan enkele minuten duren). Tijdens een run, het scherm toont het toestel de pyrogram van de geselecteerde goed in real-time. Gebruik de pijltoetsen om de pyrogram van andere bronnen bekijken. Het invullen van een run <ol><li> Wanneer het instrument bevestigt dat de run is voltooid en de run bestand is opgeslagen op de USB-stick, druk op &quot;Close&quot;. </li><li> Verwijder de USB-stick. Indien het werd verwijderd voordat de run klaar, steek de USB-stick. Selecteer &quot;Beheer&quot; en vervolgens &quot;Copy-opgeslagen Runs&quot;. </li><li> De run-bestand kan nu worden geopend en geanalyseerd met behulp van het instrument software en vergelekeneen bibliotheek van bekende bacteriën met de Identifire software. </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark PCR Handbook. , (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark Q24 User Manual. , (2012).</li><li>Elahi, E., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+a+tool+for+DNA+sequencing+analysis.">Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis.</a> Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).</li><li>Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+and+accurate+detection+platform+for+single+nucleotide+polymorphisms.">Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms.</a> Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).</li><li>Langaee, T., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+analyses+by+pyrosequencing.">Genetic variation analyses by pyrosequencing.</a> Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).</li><li>Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+pyrosequencing+reads+suffice+for+accurate+microbial+community+analysis.">Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis.</a> Nucleic Acids Res. 35 (18), e120 (2007).</li><li>Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+Pyrosequencing+for+microbiology:+From+genes+to+genomes.">The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes.</a> J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).</li><li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+microbial+diversity+from+454+pyrosequencing+data.">Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data.</a> Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).</li><li>Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+DNA+sequencing+using+detection+of+pyrophosphate+release.">Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.</a> Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).</li><li>King, C., Scott-Horton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+A+simple+method+for+accurate+genotyping.">Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping.</a> J. Vis. Exp. (11), e630 (2008).</li><li>Rothberg, J. W., Heinz, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-Mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., Fehr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li></ol>

Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Qiagen. Auteurs Ahmed, Durocher, Jessen en Vardi zijn medewerkers van Qiagen Inc, dat reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.

Verschillende nieuwe next generation sequencing methoden zijn gecommercialiseerd. Drie van de meest gebruikte methoden ion halfgeleider sequencing, molecuul realtime sequencing en sequentiebepaling door synthese (SBS). 3-11 Elk van deze werkwijzen afhankelijk van sequentiebepaling door synthese maar investeren nieuwe platforms voor de detectie van de opgenomen nucleotiden. In ion halfgeleider sequencing, een enkele streng van DNA dient als een matrijs voor de sequentiebepaling streng. 12 Polymerase en nucleotiden opeenvolgend in pyrosequencing toegevoegd. Wanneer een nucleotide wordt toegevoegd aan de groeiende DNA-streng, is een waterstof-ion vrijgegeven. De waterstof ionen wordt gedetecteerd door een veldeffect transistor gebaseerde sensor. Single molecule realtime sequencing afhankelijk van de nul-stand golfgeleider (ZMW). ZMW 13 is een kleine structuur waarin een polymerase molecule is bevestigd aan de bodem van de put. Het wordt belicht zodanig dat een floregeur molecuul kan worden gedetecteerd. Elke nucleotide is gelabeld met een fluorescerend molecuul. Als fluorescent gelabeld nucleotide wordt geïncorporeerd, een detector identificeert de nucleotide. Wanneer de volgende nucleotide wordt toegevoegd, wordt de fluorescerende molecule gesplitst. 14 Sequentiebepaling door synthese (SBS) maakt gebruik van een unieke methode voor het amplificeren van de doelwit DNA zodat clusters van unieke sequenties worden gegenereerd. Single 15 matrijzen worden gegenereerd en de complementaire streng wordt gesynthetiseerd. Elk nucleotide wordt gelabeld met een fluorescerend molecuul en na elke toevoeging base de fluorescentie van de toegevoegde base wordt opgenomen.

Pyrosequencing is een snelle en accurate manier om sequentie nucleïnezuren die is gebaseerd op het principe van &quot;sequentiebepaling door synthese&quot;. &quot;Sequencing door synthese&quot; omvat met een enkelstrengs DNA-matrijs van de complementaire streng een basisstation tegelijk synthetiseren, en het detecteren van de opgenomen base (A, T, G of C) bij elke stap door detectie van een chemiluminescent signaal. Het reactiemengsel omvat pyrosequentiebepaling matrijs DNA, dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA-polymerase, ATP sulfurylase, luciferine, luciferase en apyrase. De synthese reactie wordt geïnitieerd door de toevoeging van een van de vier dNTP&#39;s en DNA polymerase de enkelstrengige gebiotinyleerde matrijs-DNA. DNA polymerase bevat de aanvullende dNTP op de mal, met de daaropvolgende afgifte van pyrofosfaat (figuur 1). ATP sulfurylase zet de verhouding pyrofosfaat aan ATP. ATP werkt als een katalysator voor de luciferase-gemedieerde omzetting van luciferine tot oxyluciferine, welkegenereert licht (figuur 2). De intensiteit van het licht is evenredig met het aantal nucleotiden opgenomen en bepaalt of een of meer specifieke dNTP&#39;s (dATP, dTTP, dGTP en dCTP) aanwezig op de matrijsstreng achtereenvolgens (figuur 3) is. Eventuele niet opgenomen dNTP wordt afgebroken door apyrase vóór toevoeging van de volgende dNTP voor de voortzetting van de synthesereactie. Deze &quot;sequentiebepaling door synthese&quot; reactie wordt herhaald met toevoeging van elk van de vier dNTPs tot de DNA-sequentie van het enkelstrengs DNA-matrijs wordt bepaald. Om een animatie van de pyrosequentiebepaling reactie te bekijken <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405movie1.mov" target="_blank">Klik hier om de film te bekijken</a> .

<table border=1>
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark PCR Master Mix, 2x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoralLoad Concentrate, 10x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Q-Solution, 5x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2, 25 mM</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-Free Water</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>129112</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978776 or 978777</td>
 <td>Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 &mu;M.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyromark Gold Q24 Reagents</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>970802</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-purity water (Milli-Q 18.2 M&Omega; x cm or equivalent)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>17-5113-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Annealing Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Denaturation Solution</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Wash Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001514</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Cartridge</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979202</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q96 HS Tip Holder Box</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979105</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Vacuum Workstation</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Plate Holder</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9022273</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Orbital shaker</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-675-297</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat block</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-718Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

pyrosequencing for microbial identification and characterization

Pyrosequencing is een veelzijdige techniek die microbiële genoom die kan worden gebruikt om bacteriële species te identificeren, onderscheiden bacteriestammen en detecteren genetische mutaties die resistentie tegen antimicrobiële middelen vergemakkelijkt. De voordelen van pyrosequentiebepaling voor microbiologie toepassingen zijn onder meer een snelle en betrouwbare high-throughput screening en accurate identificatie van microben en microbiële genoom mutaties. Pyrosequencing omvat sequentiebepaling van DNA door het synthetiseren van de complementaire streng een basisstation tegelijk, het bepalen van de specifieke nucleotide wezen opgenomen tijdens de synthesereactie. De reactie op geïmmobiliseerd enkelstrengs matrijs-DNA waar de vier deoxyribonucleotiden (dNTP) achtereenvolgens toegevoegd en de niet opgenomen dNTP enzymatisch afgebroken vóór toevoeging van de volgende dNTP de synthesereactie. Detectie van de specifieke base opgenomen in de sjabloon wordt gecontroleerd door generatie chemiluminescent signalen. De volgorde van dNTPs die de chemiluminescerende signalen produceren bepaalt de DNA sequentie van de matrijs. De real-time sequencing vermogen van pyrosequencing technologie maakt snelle microbiële identificatie in een enkele assay. Bovendien is de pyrosequencing instrument kan analyseren volledige genetische diversiteit van antimicrobiële resistentie, inclusief de typering van SNPs, puntmutaties, inserties en deleties, en kwantificering van meerdere genkopieën voordoen bij sommige antimicrobiële resistentie patronen.

De resultaten van een typische run pyrosequencing met de software toont de locatie van de voorwaartse en achterwaartse primers die voor amplicon productie en de sequencing primer voor de pyrosequencing reactie binnen het geconserveerde 16S ribosomale sequentie (Figuur 10). De hypervariabele sequentie tussen de primer plaatsen maakt bacteriële identificatie van een groot aantal bacteriesoorten met de geconserveerde sequentie primer (5&#39;-TACATGCAAGTCGA). Als een interne kwaliteitscontrole, de DNA sequentie bracketing het variabele gebied kunnen worden gecontroleerd om te verzekeren dat de juiste DNA gebied geanalyseerd . De pyrosequentiebepaling software maakt vergelijking en aanpassing van de gegenereerde sequentie een interne database van bacteriële ribosomale sequenties voor identificatie van bacteriën. Daarnaast kan een sequentie worden geanalyseerd om mutaties die antibioticum resistentie bepalen. Bijvoorbeeld, analyse van mutaties in het 23S ribosomale genen Helicobacter pylori toont twee mutatie patronen (GAA of AGA) dat resistentie tegen antibiotica verlenen (figuur 11). Analyse van meerdere isolaten van dezelfde patiënt kunnen gelijktijdig worden getest op het ontstaan ​​van resistentie tegen geneesmiddelen te volgen in de tijd om te helpen bij epidemiologisch onderzoek naar resistentie tegen antibiotica uitbraken. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig1.jpg" /> Figuur 1. Gebiotinyleerd PCR-product wordt gebruikt als een sjabloon om dNTP nemen door DNA polymerase, waardoor de vorming van pyrofosfaat (PPi). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig2.jpg" /> Figuur 2. ATP sulfurylase converteert verhouding pyrofosfaat aan ATP. ATP katalyseert de luciferase-gemedieerde omzetting van luciferine tot oxyluciferine, dat licht dat pro genereertgepasseerde de hoeveelheid ATP. Het licht wordt opgenomen als piek op de pyrogram spoor en geeft nucleotide incorporatie. De niet opgenomen dNTPs zijn afgebroken door apyrase voordat de volgende dNTP wordt toegevoegd voor de voortzetting van de synthese. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig3.jpg" /> Figuur 3. De intensiteit van het opgewekte licht geeft aan of een of meer specifieke dNTP&#39;s (dATP, dTTP, dGTP en dCTP) werd achtereenvolgens opgenomen op de matrijsstreng. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig4.jpg" /> Figuur 4. Stroomschema voor de bereiding van master mix aan het gebiotinyleerde PCR-product te immobiliseren. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig5.jpg" /> ge = &quot;altijd&quot;&gt; Figuur 5. PyroMark werkstation, met PCR-plaat, PyroMark plaat, en dal locaties. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig6.jpg" /> Figuur 6. Locaties van de Vacuum schakelaar aan en uit posities. <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig7.jpg" /> Figuur 7. Vacuüm tool. Deskundige behandeling van het vacuüm tool. <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig8.jpg" /> Figuur 8. Cartridge poort met cartridge geopend in plaats. <img alt="Figuur 9" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig9.jpg" /> Figuur 9. Cartridge correct geplaatst met poort gesloten. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; altijd &quot;&gt; <img alt="Figuur 10" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig10.jpg" /> Figuur 10. Pyrosequencing based bacteriële identificatieresultaten. PCR primers ontworpen voor geconserveerde gebieden van de DNA-matrijs en de primer sequentie onmiddellijk stroomopwaarts van een goed gekarakteriseerd identificeren hypervariabele DNA sequentie in het amplicon (in blauw). <img alt="Figuur 11" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig11.jpg"/> Figuur 11. Detectie van antibiotica resistentie in Helicobacter pylori met pyrosequencing. Analyse van de mutaties in het 23S genen die antibacteriële resistentie in Helicobacter pylori met GAA of AGA sequenties. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <table border="1"><tbody><tr> &lt;td&gt; Component </td><td> Volume per reactie </td><td> Eindconcentratie </td></tr><tr><td> Pyro PCR Master Mix, 2x </td><td> 12,5 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> CoralLoad Concentrate, 10x </td><td> 2,5 pl </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl2 (optioneel) </td><td> Veranderlijk </td><td> ≥ 1,5 mM </td></tr><tr><td> Q-Solution, 5x (optioneel) </td><td> 5 pi </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Primer A / Primer B </td><td> Variabele / Variabele </td><td> 0.2 μM/0.2 uM </td></tr><tr><td> RNase-free water </td><td> Veranderlijk </td><td> - </td></tr><tr><td> Totaal Volume (na toevoeging van het template-DNA) </td><td> 25 gl </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. PCR reactiemengsel. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td></td><td> Aanvullende opmerkingen </td></tr><tr><td> Eerste PCR activeringsstap </td><td> 15 min </td><td> 95 ° C </td><td> HotStartTaq DNA Polymerase geactiveerd </td></tr><tr><td> 3 stap fietsen: Denaturatie </td><td> 30 sec </td><td> 94 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Gloeien </td><td> 30 sec </td><td> 60 ° C 56 ° C </td><td> Voor genomisch DNA Voor bisulfiet omgezet DNA </td></tr><tr><td> Uitbreiding </td><td> 30 sec </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Aantal cycli </td><td> 45 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laatste verlenging </td><td> 10 min </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 2. PCR Cycle Specificaties.

Watch this Scientific Journal Video about Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization at JoVE.com

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is een veelzijdige techniek die microbiële genoom die kan worden gebruikt om bacteriële species te identificeren, discrimineren bacteriestammen en detecteren genetische mutaties die resistentie tegen antimicrobiële middelen vergemakkelijkt. In deze video, zal de procedure voor microbiële amplicon generatie, amplicon pyrosequencing, en DNA-sequentie-analyse worden aangetoond.

Pyrosequentiebepaling voor Microbiële identificatie en karakterisering

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Microbiële gemeenschappen in de natuur en laboratorium - Interview

Biology of Microbial Communities  - Interview

Biologie van microbiële gemeenschappen - Interview

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: een eenvoudige methode voor Nauwkeurige Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

Venster op een Microworld: Eenvoudig Microfluïdische Systemen voor het bestuderen van microbiële transport in poreuze media

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Het gebruik van chemostaten in Microbiële Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Isolatie van specifieke genomische regio en identificatie van geassocieerde moleculen door enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

De analyse van de promotor van de plant: Identificatie en karakterisering van Root knobbeltje specifieke promotor in de gemeenschappelijke Boon

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

Begeleide Protocol voor fecale microbiële karakterisering door 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Identificatie, isolatie en karakterisering van fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en myogene voorlopercellen (MP's) in skeletspieren bij de rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...