Name: use of in vivo imaging to monitor the progression of experimental mouse cytomegalovirus infection in neonates
Uploaded: 2013-07-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates at JoVE.com

Vi takker Lee Tuddenham (IBMC, Strasbourg) for å forsterke og titrering mCMV-Luc og Thomas Baumert (INSERM U748, Strasbourg) om tillatelse til å bruke Dyreavdelingen ved Institutt for virologi. Økonomisk støtte fra INSERM, Université de Strasbourg og Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) er bekreftet. Den første deltakelse av Sonia Beroud og Laetitia LELIEUR under Master prosjekt er også anerkjent.

En. Utarbeidelse av Viral Suspension <ol><li> Skaff Smith stamme av mCMV uttrykke Luciferase (mCMV-Luc 15) fra Ulrich Koszninowski laboratorium. I denne rekombinant, er luciferase-genet insatt i IE2-lokuset av mCMV genomet. </li><li> Å forsterke mCMV-Luc, infisere en murine benmarg stromal cellelinje (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) med mCMV på ulike mangfold av infeksjon (MOI 0,001 mot 1) 16. For dette, tilsett viruset til dyrkede celler i serum-fritt medium ved 37 ° C. Etter en time, fjer...

<ol>
	<li>Loewendorf, A., Benedict, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+innate+and+adaptive+immune+defenses+by+cytomegalovirus:+timing+is+everything.">Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything.</a> J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).</li><li>Lischka, P., Zimmermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+strategies+to+combat+cytomegalovirus+infections+in+transplant+recipients.">Antiviral strategies to combat cytomegalovirus infections in transplant recipients.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 8, 541-548 (2008).</li><li>Johnsen, J. I., Baryawno, N., Soderberg-Naucler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+human+cytomegalovirus+a+target+in+cancer+therapy?.">Is human cytomegalovirus a target in cancer therapy?.</a> Oncotarget. 2, 1329-1338 (2011).</li><li>Morein, B., Abusugra, I., Blomqvist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+in+neonates.">Immunity in neonates.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 87, 207-213 (2002).</li><li>Zaghouani, H., Hoeman, C. M., Adkins, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+immunity:+faulty+T-helpers+and+the+shortcomings+of+dendritic+cells.">Neonatal immunity: faulty T-helpers and the shortcomings of dendritic cells.</a> Trends Immunol. 30, 585-591 (2009).</li><li>Morein, B., Blomqvist, G., Hu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responsiveness+in+the+neonatal+period.">Immune responsiveness in the neonatal period.</a> J. Comp. Pathol. 137, 27-31 (2007).</li><li>Cheeran, M. C., Lokensgard, J. R., Schleiss, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathogenesis+of+congenital+cytomegalovirus+infection:+disease+mechanisms+and+prospects+for+intervention.">Neuropathogenesis of congenital cytomegalovirus infection: disease mechanisms and prospects for intervention.</a> Clin. Microbiol. Rev. 22, 99-126 (2009).</li><li>Tsutsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cytomegalovirus+infection+on+embryogenesis+and+brain+development.">Effects of cytomegalovirus infection on embryogenesis and brain development.</a> Congenit. Anom. (Kyoto). 49, 47-55 (2009).</li><li>Sancho-Shimizu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+susceptibility+to+herpes+simplex+virus+1+encephalitis+in+mice+and+humans.">Genetic susceptibility to herpes simplex virus 1 encephalitis in mice and humans.</a> Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 7, 495-505 (2007).</li><li>Crozat, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+MCMV+resistome+by+ENU+mutagenesis.">Analysis of the MCMV resistome by ENU mutagenesis.</a> Mamm. Genome. 17, 398-406 (2006).</li><li>Juanjuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+for+congenital+CMV+infection+and+hearing+impairment.">Murine model for congenital CMV infection and hearing impairment.</a> Virol. J. 8, 70 (2011).</li><li>Koontz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+development+of+the+brain+after+focal+herpesvirus+infection+of+the+central+nervous+system.">Altered development of the brain after focal herpesvirus infection of the central nervous system.</a> J. Exp. Med. 205, 423-435 (2008).</li><li>Bantug, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+lymphocytes+control+murine+cytomegalovirus+replication+in+the+central+nervous+system+of+newborn+animals.">CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals.</a> J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).</li><li>Wells, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+welfare+and+the+3Rs+in+European+biomedical+research.">Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).</li><li>Sacher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cell+types+in+cytomegalovirus+infection+in+vivo.">The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo.</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).</li><li>Lutarewych, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+murine+cytomegalovirus+in+a+continuous+bone+marrow-derived+stromal+cell+line+(M2-10B4).">Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4).</a> J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).</li></ol>

Ved hjelp av in vivo imaging teknologi for å overvåke mCMV-Luc formidling i mus nyfødte, kunne vi observere viral spredning til hjernen av muterte dyr, i motsetning til vill-type. Ytterligere disseksjon av dyret og ex vivo avbildning av hjernen bekreftet tilstedeværelsen av luminescerende virus i det sentrale nervesystemet. I tillegg har vi også utført immunhistokjemi (ikke vist) på hjernen tynne snitt med et antistoff spesifikt for mCMV E1 tidlig protein og observerte at faktisk er mCMV stede i...

Humant cytomegalovirus (HCMV/HHV-5) er et medlem av herpes-virus β-familien. HCMV er en svært utbredt, opportunistisk patogen som vanligvis ervervet tidlig i livet som en asymptomatisk infeksjon en. Som alle herpesvirus, vedvarer HCMV gjennom hele levetiden av verten som immunsystem tett styrer virusreplikasjon. Episoder med viral reaktivering meste skjer hos immunsupprimerte individer som transplanterte pasienter som får medisiner for å forebygge pode avvisning to. Hos voksne, har HCMV også vært knyttet til glioblastomas tre. I tillegg er HCMV en fremtredende patogen for nyfødte med umoden immunitet 4-6. Primær infeksjon i fosteret eller det nyfødte barnet kan ha alvorlige konsekvenser. HCMV infeksjon er den vanligste smittsomme årsak til medfødte misdannelser og barndommen lidelser i utviklede land. Det er anslått at forekomsten av neonatal HCMV infeksjon påvirker 0,5-1% of alle levendefødte hvorav 5-10% vil lide av alvorlige symptomer som microcephaly eller lillehjernen hypoplasia. I tillegg vil 10% av de infiserte spedbarn med subklinisk virusinfeksjon senere utvikle sequellae fører til mental retardasjon, hørselstap, visuelle defekter eller beslag og epilepsi 7,8. I motsetning til andre humant herpes slik som herpes simplex 1 (HSV-1/HHV-1) som kan inokulert til mus via forskjellige ruter for injeksjon 9, er cytomegalovirus replikasjon arts-spesifikk. Denne funksjonen har sterkt hemmet undersøkelser av HCMV patogenesen som er utført i ulike dyremodeller (mus, rotte, marsvin, rhesus ape) og deres respektive ekte vertsspesifikke CMVs. Alle CMVs vise betydelige likheter i genomet størrelse og organisering, vev tropismeanalyse og regulering av genuttrykk. De har også indusere lignende patologi i sine respektive vert. Til tross for genomisk diversitet væretween HCMV og mus cytomegalovirus (mCMV) (50% av ORF&#39;er som er tilstede i human virus er identifisert i det murine CMV), har musemodell nylig vist seg å være fordelaktig, hovedsakelig fordi mutantstammer kan bli testet for deres evne til å kontrollere viral replikasjon in vivo. Dette har ført til en genetisk skjerm som gjorde en estimering av antall mus gener uttrykt i det voksne stadiet som utgjer &quot;resistome&quot; til dette viruset ti. Samlet tilsier dette at mCMV-infiserte mus representerer en attraktiv modell for studiet av host-virus interaksjoner hos voksne. Utforskning av medfødt CMV-infeksjon er mer komplisert fordi forskjeller i placenta lag organiseringen mellom menneske og mus svekke mor til foster overføring av viral infeksjon i mus. Nylig har direkte innsprøyting av mCMV i morkaken på dag 12.5 av svangerskapet aktivert hjerne infeksjon av mus nyfødte som førte til nedsatt hørsel 11. Men de fleste jegnvestigations nå bruke intraperitoneal injeksjon av 4-20 timer gamle nyfødte for å gi systemiske viral spredning kan føre til hematogenous hjerne infeksjon, en modell som er mer relevant enn for en intrakranial injeksjon. Denne protokollen gitt viktig innsikt inn i CMV-patogenese og mer spesielt, ble det vist at mCMV infeksjon hos nyfødte resulterer i viral replikasjon i neuronale og glial celler lokalisert i inflammatoriske foci som er infiltrert med mononukleære celler som makrofager 12. Denne rapporten også beskrevet endret morphogenesis av lillehjernen akkompagnert med redusert kornet nervecellen spredning og migrasjon og induksjon av flere interferon-stimulert gener. Den viktige rolle av CD8 + T-celler for kontroll av mCMV i sentralnervesystemet ble også rapportert av samme gruppe 13.. Et viktig aspekt å vurdere når analysere den patologiske effekten av en mikrobe er dynamikken i infisereion. I tilfelle av mCMV, er det spesielt viktig å utforske og kvantifisere progresjon av viral spredning inn i utviklingen av hjernen for å forstå og forutse omfanget av de fremtidige synaptisk skader. Tradisjonelt krever kvantifisering av progresjonen av en infeksjon det faste ofring av infiserte dyr til titeren patogenet i vev, for eksempel hjerne, som ellers er utilgjengelige. Denne typen protokollen er nå utfordret av nødvendig forbedring av dyrevelferd og 3R (Reduser, begrensning, Erstatt) prinsipper 14. Ved hjelp av in vivo avbildning teknologiene kan medføre at en drastisk reduksjon av det antall dyr som er nødvendig i in vivo infeksjon eksperimenter. Her rapporterer vi og beskrive en tid-retters analyse av viral spredning inn i hjernen ved intraperitoneal mCMV-Luc injeksjon til mus nyfødte. Ved hjelp av de samme dyrene, sporet vi og overvåkes in vivo områder med intens viral replikasjon i løpet av en to-ukers periode.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W3523A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>319112</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-4897</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>CentraVet</td>
			<td>Ket 201</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine/Vetranal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46995</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>P0436500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>gentamycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>carboxymethylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4888</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3886</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>IVIS 50</td>
			<td>Caliper/Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of in vivo imaging to monitor the progression of experimental mouse cytomegalovirus infection in neonates

Human cytomegalovirus (HCMV eller HHV-5) er en livstruende patogen i immun-kompromittert personer. Ved medfødt eller neonatal infeksjon, kan viruset infisere og gjenskape i utviklingen av hjernen, som kan gi alvorlige nevrologiske skader, inkludert døvhet og mental retardasjon. Til tross for de potensielle alvorlighetsgraden av symptomene, er de terapeutiske muligheter begrenset av utilgjengelighet av en vaksine, og fraværet av en spesifikk antiviral terapi. Videre er en nøyaktig beskrivelse av de molekylære hendelser som skjer i løpet av infeksjon av sentralnervesystemet (CNS) fortsatt mangler siden observasjoner for det meste stammer fra den obduksjon av infiserte barn. Flere dyremodeller, for eksempel rhesus macaque CMV, har blitt utviklet og gitt viktig innsikt i CMV patogenesen i CNS. Imidlertid, til tross for sin evolusjonære nærhet med mennesker, ble denne modellen er begrenset av det intrakraniale inokuleringen prosedyren brukt for å infisere dyrene og ulemperistently indusere CNS infeksjon. Videre har etiske hensyn fremmet utviklingen av alternative modeller, blant annet neonatal infeksjon av nyfødte mus med mus cytomegalovirus (mCMV) har nylig ført til betydelige fremskritt. For eksempel, ble det rapportert at intraperitoneal injeksjon av mCMV til Balb / c nyfødte fører til infeksjon av neuroner og glialceller i bestemte områder av hjernen. Disse funnene antydet at eksperimentell inokulering av mus kan rekapitulere underskudd indusert av HCMV infeksjon hos barn. Ikke desto mindre er en dynamisk analyse av mCMV infeksjon av nyfødte vanskelig å utføre fordi den klassiske metode krever at man ofrer en betydelig antall dyr ved forskjellige tidspunkt for å analysere den virale belastning og / eller immun-relaterte parametere. For å omgå denne flaskehalsen og for å muliggjøre fremtidige undersøkelser av sjeldne muterte dyr, søkte vi in vivo avbildning teknologi for å utføre en tid-retters analyse av viral formidling i hjernen ved perifer injeksjon av en rekombinant mCMV uttrykke luciferase til C57BL / 6 nyfødte.

Et representativt eksperiment er vist i figur 1.. Ved intraperitoneal injeksjon av 50 PFUs av mCMV-Luc (Panel A viser en lignende injeksjon utføres med Metylenblått å visualisere subkutant av nålen), var nyfødte bedøvet og fikk samtidig 0,3 mg av luciferase substrat (Luciferin, Caliper). Femten minutter senere, ble dyrene plassert ventral siden opp i oppkjøpet kammer av IVIS 50 (In Vivo Imaging System, Caliper) og lyset slippes ut av hele dyret ble fanget under en 10 sek eksponering. Panel B vise...

Watch this Scientific Journal Video about Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates at JoVE.com

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human cytomegalovirus (HCMV) infeksjon av nyfødte er en viktig årsak til mental retardasjon, men de molekylære hendelser som fører til virus-indusert patogenesen er fortsatt dårlig forstått. For å undersøke dynamikken i hjernen infeksjon, tilpasset vi hele dyr<em&gt; In vivo</em&gt; Bildebehandling for å utføre tid-retters analyse av nyfødte infisert med en luciferase-rekombinant virus.

Bruk av<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging å overvåke progresjonen of Experimental Mouse Cytomegalovirus infeksjon hos nyfødte

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Bruk av kunstig Oppspytt Medium til Test antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Forhold mer relevant for Cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

To metoder for Heterokaryon Dannelse å oppdage HCV Restriction faktorer

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Påvisning av en Neuro-Invasive betennelsesskade Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo avbildning metode for å skille akutte og kroniske betennelser

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Bruk av Fluorescent måloppstill for Vurdering av Cell Responses T<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Imaging av in situ interferon gamma Production i Mouse milt etter Listeria monocytogenes infeksjon

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

Isolering av vev i sentralnervesystemet og tilhørende meninger for nedstrømsanalyse av immunceller

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...