Name: techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis
Uploaded: 2013-08-02T12:00:00
Duration: 12 min 1 s
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The authors wish to thank: Ms. Alexia Saunders and Ms. Michelle McPhedran for experimental assistance; Ms. Helen Feng for electrode fabrication; Dr. Penny Allen and Dr. Jonathan Yeoh for surgical assistance; Staff of the Royal Victorian Eye and Ear Hospital's Biological Research Centre for animal care; Prof. Rob Shepherd for general guidance throughout; and Dr. Bryony Nayagam and Mr. Ronald Leung for critical comments on a draft form of the manuscript.
This work was performed at the Bionics Institute and St Vincent's Hospital, Melbourne. Funding was provided by the Ian Potter Foundation, the John T Reid Charitable Trusts, and the Australian Research Council through its Special Research Initiative in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute acknowledges the support it receives from the Victorian Government through its Operational Infrastructure Support Program.

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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

प्रत्यारोपण की सुरक्षा का आकलन preclinical अध्ययन के लिए एक प्राथमिक विचार है. एक रेटिना कृत्रिम अंग मानव में प्रत्यारोपित किया जा सकता है इससे पहले कि यह है कि यह किसी भी नुकसान का कारण नहीं होगा कि यह पुष्टि करने के लिए आवश्यक है. यह प्रत्यारोपण biocompatibility के 17-23 के साथ ही 24-26 पुरानी बिजली की उत्तेजना के कारण हो सकता है कि किसी भी संभावित नुकसान दोनों का मूल्यांकन की आवश्यकता है. ऐसे कर्णावत प्रत्यारोपण के रूप में इसी तरह की तंत्रिका कृत्रिम अंग, अनुभव के साथ, उत्तेजना की व्यापक रेंज, और ऊतकों को नुकसान के 27 कारण नहीं है कि शारीरिक, मापदंडों में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. हालांकि, रेटिना अन्य आरोपण साइटों के लिए अलग विशेषताओं और इसलिए सटीक सीमा सुरक्षा (जैसे अधिकतम चार्ज घनत्व के रूप में) अन्य प्रणालियों में पिछले अध्ययनों से ग्रहण नहीं किया जा सकता है. प्रभारी घनत्व सक्रिय इलेक्ट्रोड स्थलों पर सबसे अधिक हैं और इस नुकसान के लिए सबसे बड़ी क्षमता के साथ मेल खाती है. सीधे आसन्न ऊतकों स्थानीयकृत करने के लिए इसलिए एक विधिव्यक्तिगत रूप से सक्रिय इलेक्ट्रोड को बहुत इन अध्ययनों की उपयोगिता बढ़ जाएगी. प्रत्यारोपण के विशिष्ट क्षेत्रों के लिए आसन्न ऊतकों को भी करीब निरीक्षण के लिए डाला जा सकता है. यह लक्षित दृष्टिकोण &quot;बुरी स्थिति&quot; जांच की गई थी कि बनाए रखना है विश्वास, whilst विश्लेषण किया जा करने के लिए कम वर्गों परमिट. यहाँ वर्णित स्क्लेरल डाई स्थानीयकरण विधि बड़े पैमाने पर हाथ के आकार और ढाला सिलिकॉन / पं. इलेक्ट्रोड सरणियों 28-30 के साथ परीक्षण किया गया है. यह पतली फिल्म पॉलियामाइड सरणियों 7,31 और भी पतली फिल्म सिलिकॉन / पं. सरणियों 32 के साथ प्रयोग किया गया है. कुछ रेटिना कृत्रिम अंग पढ़ाई intrascleral implantations 33 के साथ &quot;बुलेट आकार&quot; इलेक्ट्रोड कार्यरत हैं. वर्तमान तकनीक इलेक्ट्रोड सरणियों के इस प्रकार का आकलन करने के लिए प्रभावी होना चाहिए. पतली श्वेतपटल साथ बिल्ली के समान आँखें (पोस्टीरियर पोल 90 पर मोटाई - 200 माइक्रोन) एक सरणी में व्यक्तिगत इलेक्ट्रोड के दृश्य की अनुमति दी. बहरहाल, भले ही व्यक्ति इलेक्ट्रोदेस अपनी स्थिति को आसानी से सरणी की रूपरेखा (कदम 2.6 में प्रयुक्त के समान) में देखा जा सकता है जब एक सिलिकॉन टेम्पलेट का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है, दिखाई नहीं थे. डाई मानचित्रण डाई वर्तमान के साथ ही वर्गों प्राप्त कर रहे हैं के रूप में गैर प्रासंगिक ऊतक वर्गों को प्राप्त करने की आवश्यकता को सीमित करता है. सही इलेक्ट्रोड स्थिति अनुमान करने की क्षमता प्रासंगिक histopathological विश्लेषण और अधिक से अधिक सांख्यिकीय शक्ति की अनुमति देता है, लेकिन श्रम की लागत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल स्लाइड और ब्लेड की मात्रा कम करने से समय और लागत प्रबंधन पर एक बड़ा प्रभाव है ही नहीं. पक्षपाती है और भी बेदाग ऊतक वर्गों में दिखाई जा रही है whilst ऊतक प्रसंस्करण सामना कर सकते हैं कि डाई का उपयोग एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक विचार है. विच्छेदन पर ऊतक की डाई और अभिविन्यास की और embedding के दौरान स्थान का ज्ञान काटने की प्रक्रिया मदद करता है. यह सही ढंग से तिरछा काट नहीं है कि एक अनुभाग प्राप्त करने के लिए ब्लॉक orientating भी शामिल है और एक पूर्ण representati देता हैऊतक के पर. यह काटने के प्रदर्शन व्यक्ति डाई आवेदन, विच्छेदन और एम्बेडिंग के समय मौजूद है कि इसलिए यह महत्वपूर्ण है. समग्र प्रोटोकॉल विशेष रूप से निर्धारण के समय के साथ, मामूली परिवर्तन करने के लिए मजबूत है. हालांकि, आंख विच्छेदन और डाई अंकन कदम अच्छा मैनुअल निपुणता से लाभ नमूना हानिकारक से बचने के लिए उस नाजुक प्रक्रियाओं हैं. डेविडसन के लगानेवाला एक प्रत्यारोपण के पास रेटिना की artifactual टुकड़ी को कम करने के लिए प्रभावी साबित कर दिया है के रूप में, यह विच्छेदन के दौरान प्रत्यक्ष यांत्रिक क्षति को रोकने नहीं है. डेविडसन के लगानेवाला कुछ विशेष ऊतकीय और immunohistochemical प्रक्रियाओं के साथ आसानी से संगत नहीं था. इसलिए उपरोक्त वर्णित इन चरणों को संशोधित / अनुकूलन करने की आवश्यकता थी. इष्टतम परिणाम प्राप्त किया गया था जब तक धुंधला बार और सांद्रता में वृद्धिशील परिवर्तन किए गए थे - अधिक जानकारी के लिए, पूरक सामग्री को देखें. रेटिना की मात्राऊतक विज्ञान समस्याग्रस्त रहता है. रेटिना गैर सजातीय है और मोटाई और क्षेत्र centralis 34,35 से बढ़ती दूरी के साथ सेल घनत्व परिवर्तन दोनों. इसलिए, प्रत्यारोपित आँख के भीतर पड़ोसी ऊतकों की तुलना के लिए प्रयोग नहीं किया जा सकता है और एक नियंत्रण आंख बजाय कार्यरत है. जोड़ो में नियंत्रण आँख के साथ प्रत्येक अनुभाग के मिलान हमें रोग परिवर्तन की एक अधिक शक्तिशाली सांख्यिकीय तुलना देता है, एक विषय के 36 में साथी आँखों की तुलना जब रेटिना prosthetics के साथ प्रभावकारिता और सुरक्षा परिणामों के बेहतर मूल्यांकन कर रहे हैं. विशेष देखभाल की इस मात्रा का ठहराव को प्रभावित करेगा के रूप में तिरछा काटने को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए. सारांश में, के तरीकों में काफी बदले में एक अधिक कुशल पूर्व नैदानिक ​​कार्यप्रवाह करने के लिए प्रेरित किया है जो हमारे histopathological विश्लेषण, सुधार हुआ है ऊपर वर्णित है. इन तरीकों का उपयोग कर preclinical अध्ययन के परिणामों को सीधे 3 आरपी रोगियों को सुरक्षित रूप से suprachoroi साथ प्रत्यारोपित किया गया है, जिसमें एक चिकित्सीय परीक्षण के लिए नेतृत्वदाल रेटिना कृत्रिम अंग. इन विधियों रेटिना stimulators और दीर्घकालिक दाखिल करने से रोग प्रतिक्रिया मूल्यांकन किया जाना चाहिए जहां अन्य नेत्र प्रत्यारोपण के लिए दोनों प्रासंगिक हैं. इस विधि प्रत्यारोपण पर ब्याज के क्षेत्रों को विकृति की cytoarchitecture और पंजीकरण को बनाए रखने के लिए सार्थक फायदे प्रदान की. विशेष रूप से परीक्षण नहीं किया है, इन प्रक्रियाओं में से एक संशोधन एक सरणी अल्पज्ञता प्रत्यारोपित किया जाता है, खासकर जहां अन्य प्रजातियों और अन्य संरचनात्मक स्थानों में इस्तेमाल किया जा सकता है.

रेटिना कृत्रिम अंग जल्द ही गंभीर दृष्टि हानि के विभिन्न रूपों के इलाज के लिए उपयोगी नैदानिक ​​हस्तक्षेप हो सकता है. कुछ ऐसे रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा के रूप में शर्तों, (आर), आंख में photoreceptors के व्यापक अध: पतन में परिणाम है, इन तंत्रिका संकेतों में प्रकाश transducing के लिए जिम्मेदार कोशिकाओं रहे हैं. हालांकि, रेटिना के अन्य परतों में कुछ कोशिकाओं रहते हैं और एक रेटिना कृत्रिम अंग 1 के साथ बिजली की उत्तेजना के लिए संभावित लक्ष्य हैं. मानव नैदानिक ​​परीक्षणों से प्रारंभिक परिणामों इलेक्ट्रोड epiretinal 2,3, subretinal 4,5 में प्रत्यारोपित सरणियों, और intrascleral 6 स्थानों के लिए वादा किया गया है. इन उपकरणों के विभिन्न आकार के साथ विभिन्न सामग्रियों से बनाया गया, लेकिन वे सभी दृश्य विचारों को बनाने के क्रम में रेटिना के शेष व्यवहार्य न्यूरॉन्स सक्रिय करने के लिए बिजली दालों का उपयोग कर रहे हैं. हमारे व्यापक समूह (बायोनिक विजन ऑस्ट्रेलिया) progres है कि एक रेटिना प्रत्यारोपण विकसित किया गया हैsuprachoroidal इलेक्ट्रोड सरणियों (क्लीनिकल ट्रायल संख्या: NCT01603576) के साथ प्रत्यारोपित 3 आरपी रोगियों के साथ एक नैदानिक ​​प्रायोगिक अध्ययन के लिए sed. चित्रा 1A इस suprachoroidal प्रोटोटाइप रेटिना कृत्रिम अंग से पता चलता है. रोगी सुरक्षा मानव परीक्षण शुरू होने से पहले, हम (चित्रा 1 बी) preclinical मॉडल में व्यापक तीव्र और जीर्ण परीक्षण किया है, इस प्रकार नैदानिक ​​अध्ययन में सर्वोपरि है और. Histopathological आकलन, सर्जिकल प्रक्रियाओं को परिष्कृत इलेक्ट्रोड डिजाइन के माध्यम से पुनरावृति, और अंततः प्रत्यारोपण की सुरक्षा स्थापित करने के लिए आवश्यक थे. मानक क्लीनिकल पैथोलॉजी प्रथाओं के साथ dovetailed एक कुशल कार्यप्रवाह बनाए रखने के लिए, एक आयल एम्बेडिंग तकनीक कार्यरत था. यह भी आसानी से पैथोलॉजिस्ट से व्याख्या कर रहे हैं जो haematoxylin और eosin (एच एंड ई), के रूप में नैदानिक ​​मानकों के साथ तुलनीय धुंधला प्रक्रियाओं का उपयोग करने के लिए वांछनीय था. हम भी immunohistochemical विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि एक तकनीक है, में चाहता थाआगे ऊतकों के सेलुलर मूल्यांकन की सुविधा के लिए आदेश. प्रत्यारोपण सामग्री, और पुरानी बिजली की उत्तेजना की सुरक्षा के biocompatibility, सावधानी से मूल्यांकन करने की आवश्यकता है. यह सरणी के भीतर व्यक्तिगत उत्तेजक इलेक्ट्रोड से सटे नेत्र ऊतक के ऊतकविकृतिविज्ञानी जांच करने के लिए सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, सरणियों वे परीक्षण किया जा सकता है ताकि नमूने प्रसंस्करण से पहले हटा दिया जाना जरूरी है, और उनके धातु घटकों आसानी sectioned नहीं किया जा सकता है. नतीजतन, हमारे स्थापित ऊतक तैयारी प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड 7 के संबंध में ऊतक के स्थानीयकरण और मैपिंग की इजाजत नहीं थी. एक ऊतक स्थानीयकरण विधि की कमी के अलावा, मानक formaldehyde आधारित निर्धारण और प्रसंस्करण की तकनीक आंख की विभिन्न परतों के अंतर संकोचन (चित्रा 2) के लिए रेटिना की वजह से बड़े पैमाने पर कलाकृतियों और टुकड़ी में हुई. टी के गैर एकरूपता के कारणवह रेटिना, यह विशेष रूप से मात्रात्मक मापन के लिए, नियंत्रण ऊतक के साथ वैध तुलना करने के लिए मुश्किल था. इन संयुक्त सीमाएं हमारे प्रत्यारोपित सरणियों की वजह से संभावित नुकसान का सटीक आकलन जटिल. यहाँ हम इन सीमाओं पर काबू पाने के लिए उपन्यास तकनीक मौजूद है. हम तेल आधारित ऊतक विज्ञान के साथ संगतता बनाए रखने के लिए विशेष आंख नियतन और प्रसंस्करण की तकनीक 8-10 संशोधित किया है. हम नैदानिक ​​पैथोलॉजिस्ट से प्रतिक्रिया के आधार पर, तुलनीय परिणाम देने के लिए मानक ऊतकीय और immunohistochemical दाग को संशोधित किया है. स्क्लेरल ऊतक पारदर्शी प्रतिपादन के बाद, एक डाई आधारित रंग कोड suprachoroidal अंतरिक्ष से सरणी हटाने से पहले, प्रत्येक व्यक्ति इलेक्ट्रोड से सटे नेत्र ऊतक चिह्नित करने के लिए नियुक्त किया गया था. इलेक्ट्रोड सरणी और व्यक्तिगत इलेक्ट्रोड साइटों अंकन करके, नमूने सही इलेक्ट्रोड सटे क्षेत्रों से एकत्र किया जा सकता है. मेल खाने के नमूने वें से इकट्ठा किया जा सकता हैई नियंत्रण आंख जोड़ो में तुलना की सुविधा के क्रम में.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Davidson marking system</td>
			<td>Bradley Products</td>
			<td>1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5804</td>
			<td>1:1500, overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB302</td>
			<td>1:100 overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0142</td>
			<td>1:100 overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>1:25,000 30 min incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost 90&#176; yellow</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>SF41299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEX IHC Microscope Slides</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K802021-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td>10% serum/0.1% Triton X-100/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
 			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			Non-Standard Solution Preparation for Special Stains
			1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution
			<ul>
				<li>Cresyl violet 1 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Cresyl Violet Acetate Working Solution
			<ul>
				<li>1% aqueous cresyl violet stock solution 9 ml</li>
				<li>Distilled water 51 ml</li>
				<li>10% acetic acid 0.5 ml</li>
			</ul>
			Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution
			<ul>
				<li>1% Beihrich scarlet 90 ml</li>
				<li>1% acid fuchsin 10 ml</li>
				<li>Glacial acetic acid 1 ml</li>
			</ul>
			Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution
			<ul>
				<li>Phosphomolybdic acid 2.5 g</li>
				<li>Phosphotungstic acid 2.5 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Aniline Blue Solution
			<ul>
				<li>Aniline blue 2.5 g</li>
				<li>Glacial acetic acid 2 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Solutions for Immunohistochemistry
			Wash Buffer Solution
			<ul>
				<li>0.1% Triton X-100 in Phosphate buffered saline (PBS)</li>
			</ul>
			Serum Block Solution
			<ul>
				<li>10% normal goat serum/0.1% Triton X-100 in PBS</li>
			</ul>
			SUPPLEMENTARY MATERIAL
			Luxol Fast Blue
			The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml.
			Periodic Acid Schiff
			The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining.
			Masson&#8217;s Trichrome Blue
			The principle of the Masson&#39;s trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson&#39;s fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required.
			Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody
			Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and M&#252;ller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da.
			Neurofilament-200 antibody
			Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons.
			Glutamine Synthetase (GS) antibody
			Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of M&#252;ller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da.
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis

रेटिना कृत्रिम अंग के हाल ही के विकास के साथ, यह preclinical अध्ययन में इन उपकरणों की सुरक्षा का आकलन करने के लिए विश्वसनीय तकनीक विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, मानक निर्धारण, तैयारी, और स्वचालित ऊतक विज्ञान प्रक्रियाओं आदर्श नहीं हैं. यहाँ हम एक प्रत्यारोपण के लिए सीधे आसन्न रेटिना के स्वास्थ्य के मूल्यांकन के लिए नई प्रक्रिया का वर्णन है. रेटिना कृत्रिम अंग आंख ऊतक के साथ संपर्क में इलेक्ट्रोड सरणियों सुविधा. पिछले विधियों स्थानिक सरणी के भीतर व्यक्तिगत इलेक्ट्रोड से सटे नेत्र ऊतक स्थानीय बनाना करने में सक्षम नहीं किया गया है. इसके अलावा, मानक ऊतकीय प्रसंस्करण अक्सर प्रत्यारोपित आँखों का आकलन जब रेटिना परतों के सकल artifactual टुकड़ी में परिणाम है. नतीजतन, यह एक प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड सरणी के आरोपण और उत्तेजना के कारण होता है, अगर मौजूद है, स्थानीय क्षति का आकलन करने के लिए मुश्किल हो गया है. इसलिए, हम प्रत्यारोपित ई से सटे नेत्र ऊतक की पहचान करने और स्थानीयकृत करने के लिए एक विधि विकसितएक (रंग कोडित) डाई अंकन योजना का उपयोग कर, और हम artifactual रेटिना टुकड़ी को कम से कम एक आंख नियतन तकनीक संशोधित lectrodes. यह विधि भी व्यक्ति इलेक्ट्रोड और एक प्रत्यारोपण के विशिष्ट भागों के स्थानीयकरण सक्षम करने, श्वेतपटल पारदर्शी गाया. अंत में, हम histopathological आकलन की शक्ति को बढ़ाने के लिए एक मिलान नियंत्रण का इस्तेमाल किया. सारांश में, इस पद्धति का एक प्रत्यारोपित आँख में रेटिना cytoarchitecture के विश्वसनीय और कुशल भेदभाव और मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता है.

चित्रा 4 3 चित्र में दिखाया गया नमूना काटने से प्राप्त एक प्रतिनिधि अनुभाग दिखाता है. अनुभाग ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार एच ई के साथ 5 माइक्रोन मोटाई और दाग को काट दिया गया. नमूना पट्टी का कुल आकार न्यूनतम अंतर ऊतक कलाकृतियों (चित्रा -4 ए) के साथ रखा हुआ है. हरे रंग लाल (चित्रा 4 बी) की तुलना में अधिक लचीला था, हालांकि दोनों डाई चिह्नों, श्वेतपटल पर दिखाई दे रहे थे. रेटिना परतों artifactually अलग नहीं थे और रेटिना आकारिकी (चित्रा 4C) संरक्षित है. सरणी में इलेक्ट्रोड के स्थान से मेल खाती है जो डाई चिह्नों के निकट रेटिना ऊतक, आसानी से पहचाना जा सकता है. चित्रा 5 ऊतक वर्गों के प्रतिनिधि विशेष धुंधला और immunohistochemistry मौजूदा प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार दिखाता है. 5 captio संदर्भ लें चित्रविशिष्ट दाग और उनके उपयोग के लिए किए गए संशोधनों पर और अधिक विस्तार के लिए n और पूरक सामग्री. बाद के संशोधन, ये दाग और immunohistochemistry स्थापित मानकों के बराबर थे - पैथोलॉजिस्ट द्वारा सत्यापित के रूप में. <table border="1"><tbody><tr><td> प्राथमिक एंटीबॉडी और अनुमापांक के प्रकार (कोष्टक में) </td><td> GFAP (1:1500) </td><td> NF200 (1:100) </td><td> जी एस (1:100) </td></tr><tr><td> माध्यमिक एंटीबॉडी और अनुमापांक के प्रकार (कोष्टक में) </td><td> एलेक्सा Fluor 594 </td><td> एलेक्सा Fluor 488 </td><td> एलेक्सा Fluor 488 </td></tr><tr><td> माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन की अवधि </td><td> 1 घंटा </td><td> 2 घंटा </td><td> 45 मिनट </td></tr></tbody></table> तालिका 1. एंटीबॉडी के प्रकार, Titre और लेबल की अवधि. <img alt="चित्रा 1" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig1.jpg" /> चित्रा 1. SuprachoroIDAL प्रोटोटाइप इलेक्ट्रोड सरणी. एक नैदानिक ​​ग्रेड ढाला सरणी के ए) मैक्रो तस्वीर. बी) एक हस्तनिर्मित preclinical सरणी के सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़. <img alt="चित्रा 2" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig2.jpg" /> चित्रा 2. पूर्व रेटिना प्रोटोकॉल. स्टैंडर्ड ऊतकीय तरीकों इन तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया, एच एंड ई दाग, एक suprachoroidal इलेक्ट्रोड सरणी के साथ प्रत्यारोपित एक आँख के वर्गों. ए) इलेक्ट्रोड सरणी गुहा (एक सितारा द्वारा दर्शाया) के माध्यम से एक orthogonal अनुभाग. रेटिना बाहरी आँख के ऊतकों से अलग है. इस प्रत्यारोपित क्षेत्र (तीर) के नीचे विशेष रूप से स्पष्ट है. यह सरणी के प्रत्येक व्यक्ति इलेक्ट्रोड से सटे था रेटिना के जो हिस्से को निर्धारित करने के लिए असंभव है. Scalebar = 1 मिमी. बी) के पैनल में बॉक्सिंग क्षेत्र के एक उच्च बढ़ाई ए. रेटिना लेय में, नियमित रूप से स्थान दिया गया है, कई कलाकृतियों कर रहे हैंरुपये (तीर), और साथ ही tapetal परत (बिल्ली के समान आंखों में चिंतनशील परत) से बड़ी टुकड़ी. Scalebar = 100 माइक्रोन. सी) पैनल बी में बॉक्सिंग क्षेत्र के एक उच्च बढ़ाई. तीर टुकड़ी के रूप में इन विवो आघात या विकृति में एक की वजह से किया जा रहा करने का विरोध किया, प्रसंस्करण के पक्ष प्रभाव एक artifactual था, सुझाव है कि photoreceptors के बाहरी क्षेत्रों, साथ ही बरकरार रहेगा जो रंगदार उपकला, संकेत दिया. Scalebar = 20 माइक्रोन. <img alt="चित्रा 3" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig3.jpg" /> चित्रा 3. इलेक्ट्रोड-सटे ऊतक. ई. का स्थानीयकरण और विच्छेदन) बगल में एक suprachoroidal इलेक्ट्रोड सरणी के साथ एक enucleated आंख का उच्च गतिशील रेंज मैक्रो फोटो,. ए) पोस्ट डेविडसन की लगानेवाला के साथ तय हो गई है, और पूर्व सरणी हटाने के लिए, पारदर्शी श्वेतपटल के दृश्य के लिए सक्षम बनाता हैसरणी में व्यक्तिगत इलेक्ट्रोड (एक उदाहरण के तीर के साथ संकेत). बी) इलेक्ट्रोड एक पूर्वनिर्धारित डाई रंग से चिह्नित किया गया. सी) संरचनात्मक स्थलों से नियमित अंतराल पर डाई चिह्नों प्रयोगों भर में स्थिरता बनाए रखने के लिए उपयोग किया जाता है. डी) को हटाने पर सरणी, आंख नमूना स्ट्रिप्स में हाथ से विच्छेदित है. रंगीन तीर श्वेतपटल पर इलेक्ट्रोड आसन्न साइटों की दो से संकेत मिलता है. पीला धराशायी लाइन सेक्शनिंग के विमान को इंगित करता है. ई) पैनल ई से अग्रवाल एम्बेड नमूना पट्टी, फोम बायोप्सी पैड द्वारा समर्थित बाहर कटौती और एक एम्बेडिंग कैसेट में रखा की एक अगर ब्लॉक. एफ भीतर एम्बेडेड नमूना पट्टी के वृहद तस्वीर) मैक्रो तस्वीर प्रसंस्करण के दौरान खंड के आंदोलन को कम करने के लिए. <img alt="चित्रा 4" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig4.jpg" /> 4 चित्रा. नई रेटिना प्रोटोकॉल. </s<html> टुनिशिया&gt; इलेक्ट्रोड जेब युक्त ऊपर नमूना पट्टी (चित्रा 3 डी से), एच एंड ई ए) हरे और लाल रंगे क्षेत्रों (चित्रा 3 डी के रूप में एक ही तीर द्वारा इंगित) के साथ 5 माइक्रोन और दाग पर आयल एम्बेडेड, sectioned था में दिखाई दे रहे हैं एक अनुभाग चित्रा 3 डी में पीले धराशायी लाइन के स्तर पर लिया. स्केल बार = 1000 माइक्रोन. रेटिना सरणी जेब नीचे और न ही दूर से न तो अलग नहीं है. बी) के पैनल से बॉक्सिंग क्षेत्र दिखाई लाल और हरे रंग के साथ एक तीर द्वारा संकेत, और बरकरार रेटिना भर में. स्केल बार = 500 माइक्रोन. हरे रंग से सटे बरकरार, संलग्न, रेटिना दिखा पैनल बी से सी) बॉक्सिंग क्षेत्र,. स्केल बार = 50 माइक्रोन. डाई के स्थान पर एक इलेक्ट्रोड की स्थिति किसी भी अगर, हम विश्वास से बिजली की उत्तेजना के कारण होता है, क्षति के लिए आसन्न रेटिना ऊतक का आकलन कर सकते हैं इंगित करता है कि यह जानते हुए. ve_content &quot;के लिए: रखने together.within पृष्ठ =&quot; हमेशा &quot;&gt; <img alt="चित्रा 5" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig5.jpg" /> चित्रा 5. विशेष दाग और immunofluorescence का उपयोग कर संशोधित रेटिना cytohistochemistry के उदाहरण हैं. के रूप में मुख्य प्रोटोकॉल पाठ में उल्लिखित मानक formalin निर्धारण तकनीक, सामान्य धुंधला प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक परिवर्तन करने का विरोध डेविडसन का लगानेवाला, का उपयोग करें. पैथोलॉजिस्ट इन संशोधनों के बराबर धुंधला में हुई पुष्टि की है. ए) एच &amp;E; गुलाबी की eosin दाग सेल cytoplasm, कोलेजन और सहायक ऊतक विभिन्न रंगों. बी) LFB दाग माइलिन नीले cresyl बैंगनी counterstain बैंगनी haematoxylin दाग सेल नाभिक में इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि . perikaryon नीले भीतर Nissl निकायों धुंधला हो जाना और कोशिकाओं के आसपास उपग्रह कोशिकाओं को उजागर करके नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की पहचान सी) मैसन का trichrome नीले, Biebrich लाल एसिड fuchsin समाधान दाग पेशी फाईसदस्यों लाल, एनिलिन नीला दाग कोलेजन, इस मामले में श्वेतपटल, नीले डी) पीए जबकि;.. haematoxylin सेल नाभिक बैंगनी ई) पर्ल्स &#39;प्रशिया नीले counterstains जबकि तहखाने झिल्ली और संयोजी ऊतक घटकों के ग्लाइकोप्रोटीन घटकों, बैंगनी दाग रहे हैं; तटस्थ लाल दाग रंग के अलावा लाल lysosomes जबकि रक्तस्त्राव के स्थल पर, लोहा परिसरों अपमानित लाल रक्त कोशिकाओं और रिलीज से haemosiderin के गठन के एक बैंगनी रंग का उत्पादन एफ) जी एस,. मुलर कोशिकाओं 13 में पाया इस न्यूरोट्रांसमीटर अपमानजनक एंजाइम (हरे .), भीतर परमाणु परत और भीतर सीमित झिल्ली जी) एनएफ-200 के गठन मुलर सेल endfeet में मुलर सेल शरीर के साथ दोनों दिशाओं में विस्तार देखा जा सकता है, इस भारी श्रृंखला cytoskeletal प्रोटीन (हरा) सेल सोम और प्रक्रियाओं में पाया , न्यूरॉन्स 14,15 की संरचना को बनाए रखने के लिए अन्य neurofilaments साथ crosslinks. नाड़ीग्रन्थिबिल्ली के समान रेटिना में भीतर परमाणु परत के बाहरी आवासी में स्थित क्षैतिज कोशिकाओं, के axons भी डाला जाता है, जबकि कोशिकाओं और उनके axons, नाड़ीग्रन्थि सेल परत और तंत्रिका फाइबर परत में देखा जा सकता है. . DAPI (नीला) के साथ counterstaining रेटिना परतों के दृश्य एच) GFAP अनुमति देता है, इस cytoskeletal प्रोटीन (लाल), gliosis 16 के दौरान मुलर कोशिकाओं और astrocytes में proliferated को भीतरी के माध्यम से पतली एक्सटेंशन बनाने मुलर कोशिकाओं के साथ तंत्रिका फाइबर परत की परत देखी जा सकती है बाहरी रेटिना परतों. DAPI साथ counterstaining (नीला) रेटिना परतों के दृश्य के लिए अनुमति देता है. सभी पैनलों में स्केल बार = 50 माइक्रोन. भीतरी रेटिना प्रत्येक छवि के शीर्ष पर दिखाया गया है, बाहरी रेटिना subscleral प्रतिक्रिया से पता चलता है जो पैनल ई, को छोड़कर, प्रत्येक छवि के नीचे दिखाया गया है.

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